据报道，乙型肝炎蛋白x（HBx）可促进乙型肝炎病毒（HBV）相关肝细胞癌（HCC）的肿瘤发生，但其机制有待进一步研究。近日，Experimental & Molecular Medicine期刊（IF12.8）在线发表了一篇题为Circular RNA cFAM210A, degradable by HBx, inhibits HCC tumorigenesis by suppressing YBX1 transactivation的研究论文。报道了一个可被HBx沉默的circRNA cFAM210A，揭示了circRNA在HBx诱导的肝癌发生中的重要作用，并确定了cFAM210A是预防和治疗HBV相关HCC的潜在靶点。

 

 

首先，研究人员使用表达HBx的慢病毒在四种人HCC细胞系（Hep3B、HepG2、Huh7和MHCC97H）中过表达HBx蛋白。然后，进行了全转录组测序，并在HBx过表达（HBx-oe）和NC HepG2细胞中鉴定差异表达的circRNAs。结果鉴定了14个差异表达的circRNAs（8个上调，6个下调），其中cFAM210A在4种HCC细胞系中的表达变化最为明显。因此，研究人员假设cFAM210A是HBx的主要靶点。

 

Fig1. HBx调节的circRNAs的筛选和鉴定

 

进一步的研究显示，cFAM210A是由FAM210A基因NM_001098801转录本的第三个外显子通过反向剪接获得，其长度为501个核苷酸。qRT‒PCR检测发现，cFAM210A在HCC组织中的表达低于ANL（邻近非癌肝脏）组织，表明cFAM210A具有抗肿瘤作用。重要的是，cFAM210A在HBV相关ANL组织中的表达低于健康组织，表明cFAM210A可能因HBV感染而下调。此外，cFAM210A在ANL组织中的表达与HBx水平呈负相关。Kaplan‒Meier生存分析显示，cFAM210A-low组的晚期无复发生存率较差。以上结果表明，cFAM210A表达与HBV相关HCC患者的肿瘤发生呈负相关。

 

Fig2. cFAM210A表达的临床意义

 

接下来，研究人员探索了HBx是否会影响cFAM210A的生物发生或降解。结果显示，HBx不会影响cFAM210A的生物发生，但在ActinomycinD阻断cFAM210A的生物发生后，HBx过表达导致cFAM210A表达显著下调，表明HBx可以促进cFAM210A的降解。随后的实验结果显示，cFAM210A被m6A修饰，HBx过表达后其相对m6A水平升高，并且m6A位点50是cFAM210A的关键m6A位点。表明HBx可以通过提高m6A位点50的m6A水平来促进cFAM210A的降解。重要的是，cFAM210A可以被YTHDF2富集，并且在敲低YTHDF2、HRSP12或POP1时，cFAM210A被显著上调。此外，敲低YTHDF2导致cFAM210A的半衰期显著增加，并且这种增加被HBx过表达逆转。以上结果表明，HBx可以在m6A位点50促进cFAM210A的m6A修饰，m6A修饰的cFAM210A可以通过YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP途径降解。

 

Fig3. HBx通过增加cFAM210A的m6A水平来促进其降解

 

据报道，m6A甲基转移酶，如CBLL1（HAKAI）、KIAA1429（VIRMA）、METTL3、METTL14、METTL16（METT10D）、RBM15、RBM15B、WTAP和ZC3H13，可以增加RNA的m6A水平，而m6A去甲基化酶（ALKBH5和FTO）可以降低RNA的m6A水平。研究人员通过qRT‒PCR和Western blot分析发现，在HCC细胞系中HBx过表达后，RBM15（而不是其他甲基转移酶或去甲基化酶）显著上调。双荧光素酶报告基因实验进一步证实了HBx的过表达促进了RBM15的转录。此外，敲低RBM15后，cFAM210A的m6A水平和表达水平均显著降低。重要的是，通过同时过表达HBx可消除这种效应。以上结果表明，HBx可以通过转录诱导促进RBM15的表达，从而提高cFAM210A的m6A水平。

 

Fig4. HBx通过促进RBM15的表达来增加cFAM210A的m6A水平

 

接着，为了探索cFAM210A在HCC中的生物学功能，研究人员在HCC细胞系中过表达cFAM210A。结果发现，强制表达cFAM210A显著降低了HCC细胞的增殖能力，抑制了HCC细胞的干性和致瘤性。此外，cFAM210A过表达后，有5个HCC肿瘤干细胞(CSCs)标志物(CD13、CD24、CD90、CD133和EPCAM)下调。

 

Fig5. 过表达cFAM210A抑制HCC细胞的增殖、干性和致瘤性

 

缺失性实验显示，敲低cFAM210A可促进HCC细胞的增殖能力，并增强了HCC细胞的干性和致瘤性。此外，在沉默cFAM210A后，HCC中检测到的7个CSCs标志物（CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、EPCAM和ALDH1A1）均上调。综上所述，这些发现表明cFAM210A在体外和体内均能抑制HCC细胞的增殖、干性和致瘤性。

 

Fig6. 敲低cFAM210A可促进HCC细胞的增殖、干性和致瘤性

 

最后，为了探索cFAM210A在HCC肿瘤发生中的作用机制，研究人员进行了RIP-qPCR、RNA pull-down、qRT‒PCR、Western blot、双荧光素酶报告基因实验、FISH、免疫荧光等一系列实验。结果发现，感染HBV后，HBx通过促进RBM15（一种m6A甲基转移酶）的表达来增加 cFAM210A的m6A水平，从而通过YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP途径诱导cFAM210A的降解。此外，cFAM210A通过与YBX1结合并抑制其磷酸化，从而抑制YBX1反式激活MET的功能，最终抑制HCC肿瘤的发生。

 

Fig7. 作用机制示意图

 

总之，本研究鉴定了一组差异表达的circRNAs，其中cFAM210A（源自FAM210A基因转录本NM_001098801的第三个外显子的环状RNA；hg19, chr18：13681604-13682104；circBase ID：hsa_circ_0003979）的表达下降最为明显。此外，cFAM210A下调被证实可促进临床样本中HBV相关的肝癌发生，并促进HCC细胞的干性和致瘤性。机制上，HBx可以增加cFAM210A的m6A修饰，并促进其识别和降解。使用circRNA pull-down和RNA免疫沉淀（RIP）发现，cFAM210A可以与YBX1蛋白结合，从而抑制其反式激活功能。综上所述，本研究提示了circRNA在HBx诱导的肝癌生成中的重要作用，暗示cFAM210A是预防和治疗HBV相关HCC的潜在靶点。

 

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s12276-023-01108-8#Sec16

 

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