由椎间盘（IVD）退化引起的慢性腰痛（LBP）是一种严重的社会经济负担，可能导致严重的残疾。解决IVD变性的潜在致病机制可能会激发LBP的新治疗策略。近日，Advanced Science期刊（IF15.1）在线发表了一篇题为Hypoxic Preconditional Engineering Small Extracellular Vesicles Promoted Intervertebral Disc Regeneration by Activating Mir-7-5p/NF-Κb/Cxcl2 Axis的研究论文。该研究通过缺氧预处理既改善了间充质干细胞（MSCs）在恶劣微环境中的生物学功能，又促进了具有理想治疗功能的小细胞外囊泡（sEVs）的产生。揭示了缺氧预处理工程化sEVs（HP-sEVs）通过激活Mir-7-5p/NF-Κb/Cxcl2轴促进椎间盘再生的分子机制。本研究为治疗IVD退化提供了一种新的治疗策略，对于理解HP-sEVs在慢性腰部疼痛相关的IVD再生中的作用机制具有十分重要的价值。

 

 

首先，研究人员在缺氧条件下培养人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）6 h，并从缺氧预处理的hUCMSCs的条件培养基中分离HP-sEVs。鉴定实验揭示了hUCMSCs的典型纺锤状形态，并且包括CD44、CD166、CD29、CD73和CD105在内的阳性标志物在100%的细胞中表达。阴性标志物CD14、CD45、CD34和CD11b分别在4.82%、0.77%、0.35%和1.02%的细胞中表达。此外，HP-sEVs的平均直径为130.4 nm，浓度为每毫升2.1×1011个颗粒。HP-sEVs和sEVs表现出典型的双层膜结构的杯状形状。Western blot分析显示，sEVs和HP-sEVs的外泌体表面标志物（包括CD9、CD63和CD81）均呈阳性。相比之下，hUCMSC缺乏这些表面标志物。这些结果表明，HP-sEVs已成功从条件培养基中提取出来。

 

Fig1. hUCMSCs和HP-sEVs的鉴定

 

为了验证HP-sEVs在体外髓核细胞（NP细胞）中的作用，研究人员将NP细胞与PKH-26标记的HP-sEVs共同孵育24h。结果显示，PKH-26标记的HP-sEVs被NP细胞摄取并分布在细胞核周围。本研究采用TNF-α刺激NP细胞模拟体外炎症环境。结果表明，HP-sEVs抑制了TNF-α刺激后iNOS和IL-6蛋白的表达，同时上调了TNF-α诱导的IL-10蛋白的表达。免疫荧光检测发现，TNF-α刺激显著上调NP细胞中TNF-α蛋白的表达，而HP-sEVs抑制NP细胞中TNF-α表达。与TNF-α组相比，HP-sEVs组中的炎症基因MMP13和TNF-α的表达水平显著下调，而ARG1的表达水平则显著升高。以上结果表明，HP-sEVs在体外抑制TNF-α诱导的炎症环境并具有抗炎作用。

 

Fig2. HP-sEVs的抗炎作用

 

为了探索HP-sEVs是否影响NP细胞在体外炎症微环境中的生存能力，研究人员在TNF-α刺激后用HP-sEVs培养NP细胞。结果表明，sEVs和HP-sEVs均显著促进了NP细胞的增殖；HP-sEVs在增强NP细胞活力方面表现出更好的效果。此外，HP-sEVs处理显著增加了活细胞的数量，表明HP-sEVs增强了NP细胞的增殖潜力。进一步的研究发现，sEVs和HP-sEVs上调了aggrecan（其缺失是IVD退化的一个已知特征）和collagen type II的mRNA表达水平。此外，HP-sEVs+TNF-α处理的NP细胞中collagen type II的产生显著增强。以上结果表明，HP-sEVs促进NP细胞的增殖，促进蛋白聚糖合成和胶原形成。

 

Fig3. HP-sEVs促进NP细胞的增殖，促进蛋白聚糖合成和胶原形成

 

为了探索HP-sEVs在体内IVD退化治疗中的潜力，研究人员建立了SD大鼠椎间盘穿刺模型，并将sEVs和HP-sEVs注射到IVD中，PBS作为对照。结果发现，对照组IVD间隙明显狭窄，椎体产生骨赘和骨刺。与sham组相比，sEVs组的IVD空间略有缩小。相比之下，HP-sEVs组表现出与sham组相似的IVD空间，表明HP-sEVs在体内对IVD退化的治疗效果优于sEVs。此外，HP-sEVs组中的T2加权图像（T2加权MRI的高信号强度通常用于评估IVD中的蛋白聚糖）显示出白色高信号，与sham组相似。进一步的染色实验发现，HP-sEVs组比sEVs组显示出更多的再生NP组织，并且HP-sEVs组比sEVs组具有更多的II型胶原，与sham组相似。表明给药HP-sEVs在促进NP组织再生和修复体内退化的IVD方面显示出优越的生物学功能。

 

Fig4. HP-sEVs修复IVD的影像学和组织学评估

 

为了进一步验证HP-sEVs介导的抗炎、蛋白聚糖合成和胶原形成的潜在机制，研究人员采用高通量小RNA测序检测了sEVs和HP-sEVs的miRNA表达谱。结果显示，sEVs和HP-sEVs的总小RNA的计数分布不同。GO分析发现HP-sEVs中差异表达miRNAs的潜在靶基因与蛋白质磷酸化、细胞分化、转录调节和细胞粘附等生物学过程有关。KEGG通路富集分析显示HP-sEVs中富集的miRNAs靶基因参与广泛的信号通路，如MAPK信号通路、调节干细胞多能性的信号通路和RAP1信号通路。此外，研究人员对前几个差异表达的miRNAs（高表达和低表达miRNAs）进行了聚类热图和归一化表达水平验证。

 

Fig5. 通过小RNA测序发现HP-sEVs相关的miRNAs

 

为了探究HP-sEVs调控NP细胞功能的潜在机制，研究人员通过mRNA测序对HP-sEVs刺激的NP细胞的mRNA表达谱进行了检测和比较分析。KEGG通路富集分析显示差异表达基因(DEGs)主要与TNF-α/NF-κB/Cxcl2信号通路相关。KEGG关系网络和热图分布显示，Cxcl2是其中一个DEGs，与TNF-α/NF-κB信号通路密切相关，提示Cxcl2可能是TNF-α/NF-κB信号通路的关键下游基因。GO分析显示，HP-sEVs组和对照组的ECM存在差异，表明HP-sEVs可能通过促进ECM再生来修复IVD。GSEA分析显示，TNF-α/NF-κB信号通路和ECM发生改变，表明HP-sEVs可能通过调节TNF-α/NF-κB/Cxcl2信号通路促进ECM再生。

 

Fig6. 优化的HP-sEVs调控NP细胞功能和机制的转录组分析

 

为了探索HP-sEVs激活下游信号通路的miRNA，研究人员用sEVs或HP-sEVs培养NP细胞，然后进行qPCR检测HP-sEVs富集的miRNAs在NP细胞中的表达水平（前三种差异高表达或低表达miRNAs）。结果发现，miR-7-5p的表达比其他miRNAs显著上调，表明HP-sEVs通过递送miR-7-5p激活下游信号通路。进一步的研究发现，miR-7-5p可以结合p65的3’-UTR区。此外，研究人员检测了NF-κB/Cxcl2信号通路的相关蛋白。结果显示，TNF-α刺激可上调TNF-α、p-NF-κB和Cxcl2的水平，而HP-sEVs的存在可降低蛋白表达。总之，以上结果阐述了HP-sEVs影响NP细胞的分子机制，即缺氧预处理的hUCMSC分泌大量HP-sEVs。随后HP-sEVs被NP细胞内化，从而上调NP细胞中miR-7-5p的表达水平，并抑制TNF-α水平。接着，增加的miR-7-5p通过RNA诱导的沉默复合物直接靶向p65的3′-UTR，抑制p65的水平。抑制性 p65 信号可抑制Cxcl2的产生，导致蛋白聚糖形成、胶原II沉积和炎症下调。

 

Fig7. HP-sEVs通过递送miR-7-5p激活TNF-α/NF-κB/Cxcl2信号通路

 

随后，研究人员探索了miR-7-5p在HP-sEVs介导的体外IVD再生中的作用。结果显示，如miR-7-5p inhibitor治疗显著降低了NP细胞中HP-sEVs介导的TNF-α蛋白下调，并显著减弱了炎症相关基因（包括MMP3和TNF-α）的下调。此外，miR-7-5p inhibitor逆转了HP-sEVs介导的II型胶原形成和蛋白聚糖合成，而miR-7-5p mimic显著促进了aggrecan和II型胶原的表达，表明miR-7-5p处理在促进II型胶原形成和蛋白聚糖合成方面表现出与HP-sEVs相似的效果。综上所述，HP-sEVs具有抗炎作用，并主要通过递送miR-7-5p促进NP再生。

 

Fig8. miR-7-5p沉默可减轻HP-sEVs介导的抗炎作用、蛋白聚糖合成和胶原形成

 

最后，为了证明miR-7-5p在体内介导HP-sEVs促进NP再生和退化的IVD修复中的作用，研究人员在SD大鼠椎间盘穿刺模型中使用了agomir-7-5p。结果显示，Agomir-7-5p注射显著增加了IVD空间，减少了椎骨之间的摩擦。此外，agomir-7-5p组比NC和sEVs组有更多的再生NP组织，表明agomir-7-5p有助于IVD退化的修复。综上所述，HP-sEVs主要通过转移miR-7-5p促进体内NP再生和修复退化的IVD。

 

Fig9. 给药agomir-7-5p有助于退化IVD的修复

 

总之，本研究结果表明，HP-sEVs在促进IVD再生方面比正常sEVs具有更优越的功能。此外，本研究强调了HP-sEVs抑制炎症反应和促进IVD再生的潜在机制。缺氧预处理上调了sEVs中miR-7-5p的产生，外泌体miR-7-5p的富集水平显著促进了HP-sEVs对IVD退化的治疗效果。HP-sEVs通过激活miR-7-5p/NF-κB/Cxcl2轴，缓解了参与IVD退化的炎症微环境，促进了NP细胞增殖，增强了蛋白聚糖合成和胶原形成，从而促进IVD再生。因此，研究人员设想基于HP-sEV的疗法可以作为IVD退化和腰部疼痛的有希望的治疗方法。展望未来，需要更准确的分析HP-sEVs注射后的时空分布，以了解其药代动力学特征。在临床转化之前，严格优化HP-sEVs的剂量测定以完全减轻小型和大型动物模型中的LBP，并大规模生产HP-sEVs也是必不可少的。

 

Fig10. 基于HP-sEVs的IVD退化治疗的示意图

 

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202304722

 

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