基因转录本的N6-甲基腺苷（m6A）修饰在癌症中起关键作用。近日，Nature Communications（IF16.6）期刊在线发表了一篇题为CSTF2 mediated mRNA N6-methyladenosine modification drives pancreatic ductal adenocarcinoma m6A subtypes的研究论文。该研究报道了CSTF2促进mRNAs中的m6A修饰，IGF2BP2可增强具有高甲基化m6As的mRNA的稳定性，形成CSTF2-m6A-IGF2BP2轴。该m6A修饰相关轴的异常可能有助于PDAC的发展和进展，因此在PDAC精准医学中具有潜在的临床应用价值。

 

 

首先，研究人员对来自65例PDAC患者的98个胰腺样本（其中包括33对PDAC和相应的正常组织以及另外32个PDAC样本）进行了m6A测序(m6A-seq)。结果鉴定了17,996个m6A峰，其中195个高甲基化，93个低甲基化。鉴定出的m6A位点富集于经典GGACH motif和起始密码子和终止密码子附近的区域。288个失调的m6A位点在与癌症通路相关的基因（如细胞周期和上皮-间充质转化）中富集。先前报道的癌基因如CENPF、WNT7B和NTSR被发现在肿瘤中具有hyper-m6A甲基化。

 

Fig1. PDAC中m6A修饰的全转录组图谱

 

接着，研究人员根据这些差异m6A峰对PDAC患者进行无监督共识聚类分析，进一步表征了两种PDAC亚型（分别指定为S1和S2），S2 PDAC表现出与S1 PDAC不同的m6A模式，但它们在正常组织中无差异，表明亚型模式是肿瘤特异性的。此外，S1和S2 PDAC样品之间的差异甲基化m6As在S1 PDAC样本和邻近正常组织样本之间没有差异，并且与邻近正常组织和肿瘤组织之间的差异甲基化m6As有很大的重叠，表明S2 PDAC特异性m6A异常调节。随后，研究人员分析了这两种亚型与已知临床因素（如性别、年龄、吸烟状况、饮酒状况、肿瘤分期、分化、血管侵袭和淋巴结转移）的相关性。结果发现，除神经侵袭外均为负相关。进一步研究发现S2 PDAC中Bailey’s 鳞状亚型和Collisson’s典型亚型的频率明显高于S1 PDAC。生存分析显示，S2 PDAC的中位无进展生存期(PFS)时间和总生存期(OS)时间明显短于S1 PDAC。以上结果表明，通过不同的m6A修饰可区分两种PDAC亚型。

 

Fig2. 通过转录组范围的m6A修饰对PDAC进行亚型分型

 

接下来，研究人员探讨了PDAC亚型形成的机制。首先，研究人员检查了S2 PDAC中高甲基化m6A与RNA结合蛋白（RBPs）的相关性。结果发现，CSTF2（剪切刺激因子2）RNA水平与S2 PDAC中高甲基化m6A位点的水平最显著相关，且S2 PDAC中的CSTF2 RNA和蛋白水平高于S1 PDAC。此外，当在PDAC细胞系中（PANC-1和SW1990）敲低CSTF2，分别有86%和88%的差异m6A位点的甲基化水平显著降低；当在相同细胞系中异位过表达CSTF2时，8804和8554个m6A位点被高甲基化，与CSTF2敲低细胞中低甲基化的m6A有72.8%和61.7%重叠。此外，S2 PDAC中64.9%的高甲基化在CSTF2敲低细胞中是低甲基化的。总之，这些结果表明CSTF2可能调节PDAC中mRNA m6A的形成。

 

Fig3. CSTF2是S2 PDAC亚型中促进mRNA m6A沉积的关键蛋白

 

然后，研究人员探讨了CSTF2对PDAC细胞恶性表型的影响。体外实验表明，敲低CSTF2可显著抑制PDAC细胞的增殖、集落形成、细胞周期、迁移和侵袭能力。体内实验显示，CSTF2过表达/沉默显著增强/抑制PDAC肿瘤的生长速度。此外，强制表达CSTF2可促进PDAC细胞的肺转移，而敲低CSTF2则相反。

 

Fig4. 敲低CSTF2可抑制PDAC细胞的增殖和转移

 

为了探索CSTF2如何介导m6A沉积，研究人员通过分析CLIP测序数据发现，CSTF2 RNA结合位点与RNA中的m6A位点很好地重叠。之前的研究表明CSTF2可能通过MTC和RNA Pol II影响m6A的沉积。因此，研究人员对CSTF2和RNA Pol II进行了CUT&Tag测序，结果显示CSTF2和RNA Pol II的基因组结合位置有很好的重叠。具有Pol II占用的m6A峰在CSTF2敲低时m6A水平的降低明显大于没有Pol II占用的峰。此外，在Pol II占用上表现出实质性变化的基因在CSTF2敲低时也显示出m6A水平的更大降低。另外，研究发现，DNA中的CSTF2结合位点与RNA中的CSTF2结合位点和m6A位点共定位，并且共定位与RNA Pol II相关。以上结果表明，RNA Pol II确实可能在介导CSTF2调控的m6A沉积中发挥作用。

 

Fig5. RNA Pol II可能在介导CSTF2调控的m6A沉积中发挥作用

 

先前的研究报道了CSTF2可能在RNA Pol II的延伸中起到限速因子的作用，最近的一项研究表明，延长延伸速率可能有助于RNA Pol II募集m6A writer METTL3。在CSTF2敲低后，研究人员进一步对Pol II和Pol II- ser2p进行了CUT&Tag测序。结果发现，在CSTF2敲低后，低甲基化m6A基因的RNA Pol II和Pol II-Ser2P密度显著降低，而CSTF2非靶基因的RNA Pol II密度不受影响。CSTF2靶基因（如CENPF、WNT7B和NTSR1基因）的代表性基因组轨迹说明了这一点。此外，CSTF2敲低促进了PDAC细胞中新生RNA的合成，而异位过表达CSTF2减弱了新生RNA的合成，证实了CSTF2的作用降低了Pol II的延伸率。进一步的研究发现，PDAC细胞中强制CSTF2表达变化可导致RNA Pol II和METTL3相互作用的实质性变化。

 

值得注意的是，敲低CSTF2引起的整体m6A水平下降与METTL3敲低引起的m6A水平下降相当，并且METTL3敲低细胞中低甲基化的m6A与CSTF2产生的69%的m6A重叠。CSTF2敲低导致靶转录本m6A区域周围的METTL3结合减少，但CSTF2异位过表达增强了这种相互作用。这些结果有力地支持了CSTF2通过减缓Pol II的延伸来促进m6A沉积，从而促进METTL3的共转录募集。

 

Fig6. CSTF2通过延缓延伸介导m6A沉积

 

最后，研究人员探讨了m6A对PDAC中宿主RNA水平的影响，结果发现S1和S2 PDAC亚型之间的254个差异甲基化m6As中，有205个m6As（148个RNAs）对其宿主RNA水平有影响。在148个RNAs中，115个RNAs在S2 PDAC中的m6A水平和RNA水平均上调，而33个RNAs的m6A水平和RNA水平均下调。在PDAC细胞中也观察到m6A水平与RNA水平之间的正相关，其中许多RNAs的RNA水平下调在CSTF2敲低时将表现出m6A水平的低甲基化，但只有少数RNAs将显示延长的3'UTR，表明CSTF2调节的m6A可能有助于RNA水平的升高。

 

此外，研究人员进行了基于dCas13的m6A编辑和gRNA来特异性操纵m6A位点。证实了m6A水平的下调抑制了IGF2BP2的结合，导致mRNA水平和转录本半衰期的下调。强制表达IGF2BP2未能挽救m6A水平下调对转录本mRNA水平和半衰期的影响。综上所述，CSTF2调控的m6A通过IGF2BP2增强了RNA的稳定性。

 

Fig7. 异常的m6A增强mRNA的稳定性

 

总之，本研究全面破译了PDAC中转录组范围内m6A mRNA修饰的景观。鉴定了CSTF2作为m6A沉积的介质，并驱动两种PDAC亚型的形成。此外，CSTF2调控的m6A甲基化程序主要可以通过m6A稳定的reader IGF2BP2识别，从而促进致癌途径，这表明CSTF2相关的PDAC m6A亚型可以作为一种有前途的治疗策略。

 

Fig8. CSTF2在RNA m6A沉积和PDAC亚型形成中的作用模型

 

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-41861-y

 

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