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Science子刊丨LncRNA EILA通过稳定cyclin E1蛋白促进CDK4/6抑制剂在乳腺癌中的耐药性

人阅读发布时间：2023-10-19 09:56

CDK4/6抑制剂（CDK4/6i）加内分泌治疗现在是晚期HR+/HER2-乳腺癌的标准一线治疗，但对这些患者产生耐药性只是时间问题。近日，Science Advances期刊（IF13.6）发表了一篇题为LncRNA EILA promotes CDK4/6 inhibitor resistance in breast cancer by stabilizing cyclin E1 protein的研究论文。报道了一个cyclin E1相互作用的lncRNA（EILA），并揭示了其在调节cyclin E1稳定性和CDK4/6i耐药性中的作用，暗示这可能作为预测治疗反应的生物标志物和克服耐药性的潜在治疗靶点。

为了探索cyclin E1在CDK4/6i耐药细胞中的作用，研究人员首先评估了其在耐药细胞及其亲本细胞中的mRNA和蛋白质水平。结果发现，cyclin E1的蛋白质水平在CDK4/6i耐药细胞中上调，而其mRNA水平保持不变。此外，cyclin E1蛋白在耐药细胞中比在其亲本细胞中更稳定。接着，为了确定cyclin E1表达的增加是否有助于CDK4/6i耐药，研究人员在耐药乳腺癌细胞中使用siRNA沉默cyclin E1，并评估其对帕博西尼的敏感性。结果显示，cyclin E1敲低恢复了CDK4/6i耐药细胞对帕博西尼的敏感性。表明cyclin E1的失调是导致CDK4/6i耐药的原因。

Fig1. cyclin E1失调促进CDK4/6抑制剂在乳腺癌细胞中的耐药性

之前的研究发现lncRNA DILA1可通过阻断cyclin D1降解来促进他莫昔芬耐药性，表明lncRNA在细胞周期调节和耐药性中发挥关键作用。为了鉴定可能与cyclin E1蛋白相互作用并促进CDK4/6i耐药的lncRNAs，研究人员进行了RIP-seq和lncRNA测序。结果显示，RIP-seq鉴定了52个cyclin E1相互作用lncRNAs。lncRNA测序总共鉴定出829个在CDK4/6i耐药细胞中上调的lncRNAs。在两个测序中均富集的lncRNAs有5个(AC093297、LINC00664、PVT1、NRSN2-AS1和SNHG17)，其中，只有敲低LINC00664才显著恢复了CDK4/6i敏感性。因此，LINC00664被鉴定为负责CDK4/6i耐药性的cyclin E1相互作用的lncRNA (EILA)。核质分离和ISH试验显示EILA主要定位于细胞核，并在耐药细胞中上调。RIP、RNA pull-down和Western blot进一步证实了EILA可直接与cyclin E1相互作用。此外，FISH和免疫荧光实验证实了EILA和cyclin E1在CDK4/6i耐药细胞的细胞核中共定位。以上结果表明EILA直接与耐药细胞细胞核内的cyclin E1相互作用，可能在耐药细胞对CDK4/6抑制剂的耐药过程中发挥重要作用。

Fig2. CDK4/6i耐药乳腺癌细胞表达更高水平的cyclin E1蛋白和cyclin E1相互作用的lncRNA EILA

为了评估EILA在乳腺癌中的临床意义，研究人员分析了来自TCGA-BRCA数据库的109对正常和肿瘤组织的RNA测序数据。结果显示，EILA在肿瘤组织中的表达明显高于正常组织。临床样本qRT-PCR检测和RNA ISH进一步证实了EILA在肿瘤组织中表达上调。此外，研究发现EILA的高表达与乳腺癌患者较短的无病生存期(DFS)相关。在ER+/HER2-乳腺癌患者中，EILA的高表达与较差的临床预后相关。进一步的研究发现，EILA的表达与cyclin E1蛋白水平呈正相关，并且EILA过表达与细胞周期进展和细胞增殖呈正相关。这些发现表明EILA是一种预后生物标志物，并与乳腺癌细胞周期进展的正调节相关。

Fig3. EILA预测乳腺癌患者预后不良

随后，研究人员通过功能缺失性和获得性实验探索了EILA的生物学功能。结果显示，EILA敲低降低了CDK4/6i耐药细胞的细胞增殖并恢复了帕博西尼敏感性。此外，EILA敲低降低了DNA合成，导致G1-S期阻滞，并且帕博西尼治疗的降低程度更大。另外，EILA敲低诱导了耐药细胞衰老，帕博西尼进一步增强了这一作用。而过表达EILA则得到相反的结果。这些发现表明EILA能够促进乳腺癌细胞对CDK4/6i的耐药性。

Fig4. EILA是CDK4/6抑制剂耐药所必需的

接下来的机制研究发现，EILA的发夹A与cyclin E1的羧基末端结构域相互作用，并通过阻碍cyclin E1与FBXW7的结合和抑制其泛素化介导的蛋白酶体降解来稳定cyclin E1，从而促进CDK46抑制剂在乳腺癌中的耐药性。此外，EILA受CTCF/CDK8/TFII-I复合物的转录调节，并且可以被CDK8抑制剂抑制。

Fig5. EILA的发夹A通过与其c端结构域相互作用来稳定cyclin E1

为了进一步确定EILA是否促进体内乳腺癌细胞的CDK4/6i耐药性，研究人员构建了异种移植肿瘤模型。结果显示，EILA特异性ASO显著降低了肿瘤生长，帕博西尼和EILA特异性ASO联合用药进一步缩小了肿瘤，并且对小鼠体重几乎没有影响。此外，EILA特异性ASO显著降低了EILA表达和cyclin E1蛋白水平，并显著降低了Ki67和pRb的表达，帕博西尼和EILA特异性ASO联合用药更大程度地降低了它们的表达。这些结果表明，用特异性ASOs靶向EILA表达可以克服体内CDK4/6i耐药性。

Fig6. EILA在体内促进CDK4/6抑制剂的耐药性

最后，研究人员进一步验证了EILA在CDK4/6i耐药中的临床意义。结果显示，高EILA表达预示着接受CDK4/6抑制剂治疗的ER+晚期乳腺癌患者PFS缩短。同样，高cyclin E1蛋白表达也与这些患者的不良临床预后相关。此外，研究人员在CDK4/6抑制剂治疗前和进展后，对这些患者进行了7次成对活检。结果发现，耐药肿瘤表达的EILA水平高于naïve肿瘤，cyclin E1蛋白上调。这些结果表明，EILA表达与CDK4/6抑制剂反应相关，并在进展后上调，可能作为CDK4/6i耐药的生物标志物和克服耐药的治疗靶点。