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IF10+客户文章丨lncRNA RIME调节ESCC中MLL1-H3K4me3介导的免疫逃逸

人阅读发布时间：2023-10-10 08:45

食管鳞状细胞癌（ESCC）免疫治疗的预测性生物标志物缺乏，免疫治疗耐药性仍有待解决。长链非编码RNA（lncRNA）在ESCC免疫逃逸和免疫治疗耐药中的作用仍有待阐明。近日，Clinical and Translational Medicine期刊（IF10.6）在线发表了一篇题为Long noncoding RNA Regulating ImMune Escape regulates mixed lineage leukaemia protein-1-H3K4me3-mediated immune escape in oesophageal squamous cell carcinoma的研究论文。报道了一个与ESCC免疫治疗预后相关的lncRNA RIME，并揭示了其介导的肿瘤免疫抑制和免疫治疗耐药，为ESCC患者免疫治疗应答的改善提供了重要见解。

据报道，TAMs（肿瘤相关巨噬细胞）在促进肿瘤进展和介导肿瘤免疫逃逸中起着至关重要的作用。为了鉴定TAM相关的lncRNAs，研究人员将ESCC细胞和ESCC肿瘤组织分离的TAMs共培养，然后对ESCC细胞进行RNA测序分析。为了筛选血浆外泌体中与免疫治疗（PD-1 mAb）预后相关的lncRNAs，研究人员对接受治疗的3名无应答患者和3名应答患者的样本进行了lncRNA测序。结果鉴定了20个被TAMs上调最多的lncRNAs和前50个在ESCC免疫治疗无应答患者中高表达的lncRNAs，并在它们交集后鉴定出2个lncRNAs。其中lncRNA LINC02096被证实与TAMs和免疫治疗反应密切相关，并将其命名为LncRNA-Regulating ImMune Escape（RIME）。

Fig1. TAM相关和免疫治疗预后相关lncRNAs的鉴定

qRT‒PCR分析证实了，当ESCC细胞与从ESCC患者中获得的TAMs一起培养时，RIME在ESCC细胞中上调。此外，在ESCC组织中观察到RIME与CD68呈正相关，表明RIME与TAMs密切相关。为了探索TAMs诱导RIME上调的潜在机制，研究人员检测了TAMs、ESCC细胞和两者外泌体中RIME的表达。结果发现，RIME在TAMs中的表达比在ESCC肿瘤细胞中的表达更丰富，并且RIME在TAMs的外泌体中的表达更高。此外，当ESCC细胞与Rab27a（外泌体分泌的关键调节因子）缺失的TAMs共培养时，RIME上调被部分抑制。表明TAMs诱导的ESCC细胞中RIME的上调部分是由于外泌体的分泌。另外，研究发现TNF-α刺激也可以上调RIME的表达。这些数据表明，RIME在肿瘤细胞中的高表达是由于TAM外泌体的传递和肿瘤微环境中TNF-α的刺激引起的。

Fig2. LncRNA RIME在ESCC患者血浆外泌体中表达上调

随后，研究人员进一步证实了RIME在ESCC PD-1 mAb无应答患者血浆中的表达上调。此外，ESCC患者血浆中的RIME比健康供者显著更高，且RIME的高表达与较差的总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)相关。由于ESCC PD-1 mAb无应答患者血浆中的RIME表达上调，因此研究人员进一步分析了RIME表达水平与免疫治疗预后之间的相关性。结果显示，RIME高表达组的OS和PFS缩短，且RIME高表达组PD-1 mAb治疗的疾病控制率(DCR)和客观缓解率(ORR)较低。此外，研究人员还进一步分析了接受PD-1 mAb和TP联合治疗的ESCC患者的血浆RIME表达水平。结果在RIME表达较高的患者中观察到反应率降低。研究人员还收集了2个治疗周期后患者的血浆样本，并评估了RIME水平是否升高或降低。qRT‒PCR分析显示，当RIME水平升高时，反应率降低。这些数据进一步支持了RIME区分可能受益于免疫治疗的患者的潜力，并且监测治疗前后的RIME表达水平有助于预测ESCC患者的预后。

Fig3. 高RIME表达与不良的免疫治疗预后相关

接下来，研究人员探索了RIME在体外和体内的生物学作用。生信分析显示，RIME与NK细胞、CD8+ T细胞、M1巨噬细胞、多种肿瘤抑制细胞以及PRF1、GZMA、细胞溶解活性等肿瘤杀伤活性指标呈负相关，提示RIME可能参与肿瘤免疫逃逸。FISH和核质分离检测结果显示，RIME在ESCC细胞的细胞核和细胞质中均有定位。因此，研究人员通过CRISPR-Cas9技术构建了RIME KO细胞。结果发现，RIME KO对ESCC细胞活力有轻微影响，同时大大增加了CD8 + T细胞的细胞毒性。结晶紫染色试验证实了RIME KO增加了ESCC细胞对细胞毒性CD8 + T细胞的敏感性。此外，共培养培养基中乳酸脱氢酶(LDH)、IFN-γ和IL-2的水平在RIME KO组中显著增加。表明RIME降低了对CD8+ T细胞毒性的敏感性，这使得肿瘤细胞逃避免疫监视并驱动肿瘤发生。

Fig4. RIME降低了对CD8+ T细胞毒性的敏感性

为了揭示受RIME影响的关键免疫反应相关基因，研究人员进行了mRNA芯片分析。结果发现，RIME KO显著下调多个免疫相关基因，包括PD-L1、IDO-1、IL-13和VISTA。qPCR分析、流式细胞术分析和免疫印迹分析进一步证明了RIME KO导致PD-L1和IDO-1表达水平显著降低，而RIME过表达显著增加PD-L1和IDO-1表达水平。而已有研究已报道了PD-L1和IDO-1在抑制CD8+ T细胞的细胞毒性和促进免疫逃逸中的作用。因此，研究人员推测RIME可能通过调节PD-L1和IDO-1表达使ESCC细胞逃避抗肿瘤免疫攻击。

Fig5. RIME通过调节PD-L1和IDO-1表达抑制CD8+ T细胞的细胞毒性和促进免疫逃逸

为了发现RIME调控PD-L1和IDO-1表达的机制，研究人员进行了RNA pull-down、MS2标记RNA亲和纯化(MS2-TRAP)和RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)等实验。结果发现，RIME与混合谱系白血病蛋白-1（MLL1）结合，防止ASB2介导的MLL1泛素化，提高MLL1的稳定性。RIME-MLL1增加程序性死亡配体1（PD-L1）和吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO-1）启动子区域的H3K4me3水平，组成性地增加PD-L1/IDO-1在肿瘤细胞中的表达，并抑制CD8+ T细胞的浸润和活化，从而促进ESCC的免疫逃避。

Fig6. lncRNA RIME调节MLL1-H3K4me3介导的免疫逃避的机制示意图

为了验证RIME在体内的功能作用，研究人员将人ESCC肿瘤组织或ESCC细胞皮下移植到NOG小鼠体内，建立患者源性异种移植(PDX)或细胞系源性异种移植(CDX)模型，即huPBMC-NOG-CDX/PDX模型。结果显示，RIME CRISPR KO显著降低了肿瘤的发展，并显示出比PD-1 mAb单一治疗更好的抗肿瘤效果。异种移植物单细胞RNA测序结果显示，RIME KO增加了CD8+ T细胞和细胞毒性CD8+ T细胞。此外，研究人员还设计了一种体内外均可使用的RIME抑制剂（RIME ASO），其对RIME有较强的抑制作用。结果显示，靶向RIME可以显著抑制肿瘤的发展，并且显示出比PD-1 mAb单一治疗更好的抗肿瘤效果。RIME抑制剂还增加了ESCC患者来源的异种移植物中CD8+ T细胞和细胞毒性CD8+ T细胞的比例。表明RIME是一个很有希望的治疗靶点。

Fig7. RIME抑制可增强食管鳞状细胞癌(ESCC)治疗的抗肿瘤免疫

最后，为了验证RIME-MLL1-H3K4me3轴在临床上与ESCC的发展相关，研究人员进行了免疫组化分析，并评估了ESCC患者肿瘤组织中CD68、MLL1、PD-L1、IDO-1、CD8和GranB的表达。结果显示，RIME表达升高组中CD68、MLL1、PD-L1、IDO-1表达升高，CD8、GranB表达降低，与RIME低表达组相反。qPCR分析也证实了RIME与ESCC组织中PD-L1/IDO-1表达密切相关。此外，IHC显示MLL1在恶性组织中表达明显上调，且MLL1高表达与ESCC患者预后较差相关。这些数据进一步证实，RIME-MLL1-H3K4me3轴在破坏ESCC患者的抗肿瘤免疫中起关键作用。