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Redox Biology（IF11.4）丨LncZFHX2促进DNA修复以介导骨关节炎病理学

人阅读发布时间：2023-09-06 11:07

关节炎最普遍的形式是骨关节炎（OA），这是一种主要由关节软骨变性、滑膜炎症、软骨下骨硬化和骨赘形成引起的无菌性炎症。虽然OA是一种全关节疾病，但其发展的一个标志是软骨内稳态失衡引起的进行性软骨和细胞外基质（ECM）损失。软骨细胞的细胞内信号触发合成代谢和分解代谢活动之间的相互作用，从而控制软骨的内稳态。COL2A1（2型胶原蛋白）和ACAN（聚集蛋白聚糖）的表达促进了ECM的积累。COL2A1和ACAN的表达受SOX9（SRY-Box转录因子9）调控。相反，MMPs（基质金属蛋白酶，例如MMP13）和ADAMTS（具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶，例如ADAMTS5）蛋白的表达增强了ECM的降解。此外，细胞衰老也被认为与骨关节炎有关。在健康成人的关节软骨中，常驻软骨细胞是静止的，且表现出低代谢活性，基质成分的周转率很小。由于软骨是无血管的，软骨细胞存在于相对缺氧的环境中，修复或再生能力有限。越来越多的证据表明，精确氧张力（pO2，从表面的6% O2到深层区域的<1%）的变化对软骨稳态至关重要，影响软骨细胞代谢，蛋白质/蛋白聚糖合成和细胞衰老等广泛的过程。软骨细胞具有丰富的线粒体，尽管存在缺氧环境，但仍会产生足够的ATP以维持适当的表型和代谢。然而，低于一定阈值的pO2有助于促进ECM合成和抑制分解代谢。鉴于这些条件，软骨细胞对pO2的变化非常敏感。

软骨细胞对低pO2反应的机制是通过缺氧诱导因子（HIFs）。HIF蛋白复合物由三个α-亚基（HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α）和一个组成型表达的 HIF-1β 亚基组成；后者存在于各种组织中，并受到pO2变异的严格调节。缺氧反应期间的主要亚型是HIF-1α，通常用作缺氧指示因子。在低pO2（2-3%）时，HIF-1α在软骨细胞中上调，而较高的pO2会降低ATP的产生。HIF-1α是早期骨骼发生过程中软骨形成的关键成分，可调节缺氧软骨形成前细胞中SOX9的表达。通过维持ECM完整性和抑制细胞凋亡，HIF-1α是软骨内稳态的存活因子，这在很大程度上是通过改变HIF-1α和HIF-2α的相对表达来调节的。HIF-1α刺激提高了软骨细胞的存活率，而该蛋白的条件缺失会导致软骨细胞死亡。

氧化应激是由活性氧（ROS）压倒细胞抗氧化能力引起的。由于软骨细胞对pO2的变化极其敏感，长时间的正常氧会严重损害软骨细胞中的DNA，如H2A组蛋白家族成员X（H2AX）的磷酸化和各种衰老表型所示。考虑到OA的衰老和缺氧在衰老中的重要性，可以通过更好地了解不同氧水平下的软骨细胞稳态来改善治疗。一个有希望的研究目标是非编码RNAs（ncRNAs），它们对软骨细胞过程的调节很重要。目前，关于生理缺氧条件下ncRNAs如何影响软骨细胞稳态的研究很少。

大约60%的DNA转录本是ncRNAs，根据长度、生物合成和作用机制进行分类。转录后，ncRNAs可能是高度保守的（例如microRNAs，miRNAs；环状RNAs，circRNAs）或相对不保守的（例如长链ncRNAs，lncRNAs）。无论如何，它们独特的二级和三级结构允许ncRNAs参与关键的生物学功能。特别是，lncRNAs影响其他RNAs的翻译，从而在基因调控网络中发挥作用。lncRNAs与其RNA靶标的结合要么为蛋白质功能创造底物，要么消除对miRNA和抑制性蛋白质效应物的接触。

近日，Redox Biology期刊（IF11.4）在线发表了一篇题为An inducible long noncoding RNA, LncZFHX2, facilitates DNA repair to mediate osteoarthritis pathology的研究论文。该研究报道了一个保守的lncRNA（LncZFHX2），其在正常软骨中被HIF-1α上调。研究发现LncZFHX2通过激活RIF1（复制时序调节因子1）驱动软骨细胞中的DNA修复。值得注意的是，LncZFHX2条件敲除小鼠在内侧半月板手术失稳后表现出严重的OA。表明存在一种新的lncRNA依赖性机制，对于维持软骨稳态至关重要。

首先，研究人员通过lncRNA微阵列鉴定出162个在常氧(pO2 = 21%)和缺氧(pO2 = 2.5%)培养的软骨细胞中差异表达的lncRNAs。随后，研究人员使用Ensembl (score>50)来检测前8个上调或下调的lncRNAs，其中有5个lncRNAs在人类和小鼠之间具有保守序列。RT-qPCR显示ENST00000553985（以下简称LncZFHX2）和ENST00000522863（以下简称LncHOXA11）是基于差异倍数（缺氧/常氧）的异常值。接着，研究人员利用ASOs进行敲低实验，以了解LncZFHX2和LncHOXA11的功能。结果显示，LncZFHX2敲低导致MMP13、ADAMTS5、P16INK4a和P21的上调，以及SOX9、COL2A1和ACAN的下调；而LncHOXA11敲低并没有显著改变蛋白质水平。FISH和RT-qPCR证实了LncZFHX2主要定位于细胞核，在受损软骨中下调。此外，研究人员通过体外转录和翻译实验证实LncZFHX2不能翻译成蛋白质。

Fig1. LncZFHX2在人类软骨细胞（HCs）中的鉴定与表征

Ensembl数据显示LncZFHX2和ENSMUST00000183822(以下简称mLncZFHX2)是高度保守的。值得注意的是，RT-qPCR检测发现，缺氧条件下，mLncZFHX2在小鼠软骨细胞(MCs)中表达升高。随后，研究人员探索了HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α对mLncZFHX2的影响。结果发现，只有过表达HIF-1α才能诱导mLncZFHX2显著升高。JASPAR数据库预测，mLncZFHX2启动子区域具有两个HIF-1α结合位点。ChIP和电泳实验显示，HIF-1α与-918 ~ -759 bp的片段相结合。荧光素酶实验进一步证实了mLncZFHX2参与调控HIF-1α，从而参与缺氧反应。

Fig2. mLncZFHX2表达与缺氧、衰老相关

为了探索mLncZFHX2与OA之间的关系，研究人员利用RNA FISH法检测了多种OA模型中mLncZFHX2的表达。结果显示，与CBA/CaCrl对照相比，自发性OA STR/Ort小鼠的mLncZFHX2水平显著降低，提示mLncZFHX2在OA中起重要作用。功能研究显示，mLncZFHX2敲低可上调MCs中的MMP13、ADAMTS5、P16INK4a和P21，下调SOX9、COL2A1和ACAN，过表达mLncZFHX2则得到相反的效果。体内实验中，研究人员使用小鼠膝关节OA模型来探索mLncZFHX2是否能抑制衰老相关变性。结果发现，mLncZFHX2能明显减轻老年小鼠软骨损伤。

Fig3. mLncZFHX2在体内和体外调节骨关节炎(OA)

由于mLncZFHX2主要位于MCs的细胞核中，研究人员推测mLncZFHX2可能与转录因子（TFs）联合起作用，以调节基因转录并影响OA进展。接下来，为了探讨mLncZFHX2是否影响基因表达，研究人员对Ad mLnc或对照腺病毒(Ad NC)处理的MCs进行了RNA-seq。结果鉴定出533个符合显著性阈值的潜在基因。其中10个基因直接受mLncZFHX2与其启动子结合的调控。RIF1在两个实验中差异最大，说明RIF1最有可能是mLncZFHX2直接调控的下游靶点。此外，ChIRP检测显示，mLncZFHX2富集于RIF1的启动子区(−1800 ~−1400)。

随后，研究人员将ChIRP分析中的所有相互作用蛋白进行银染色和质谱分析，鉴定出433种特异性偶联蛋白，并从中发现了17个TFs。JASPAR筛选发现，RIF1启动子区域含有PITX1、SOX6、STAT1、JUNB、RUNX1和KLF4的假定结合位点，而在敲低KLF4后，RIF1表达也下调。此外，研究人员通过一系列实验证实了mLncZFHX2与KLF4的结合。

接下来，研究人员想要确定KLF4是否参与调节MCs中RIF1的表达。通过JASPAR预测发现RIF1启动子区域包含6个KLF4的假定结合位点。荧光素酶实验证实，mLncZFHX2和KLF4过表达促进了HEK-293细胞中的RIF1转录。ChIP实验证实了mLncZFHX2过表达增加了KLF4与RIF1启动子的结合。以上结果表明mLncZFHX2是KLF4募集的支架，可以调节RIF1的转录。

Fig4. mLncZFHX2通过募集KLF4到RIF1启动子上调控RIF1的表达

最后，为了进一步探索mLncZFHX2在OA发病中的作用，研究人员构建了mLncZFHX2fl/fl小鼠模型，用Cre或对照腺病毒感染mLncZFHX2fl/fl原代软骨细胞，然后评估了mLncZFHX2fl/fl MCs的NHEJ（NHEJ是RIF1修复DNA双链断裂的机制）。流式细胞术发现Cre敲低mLncZFHX2后NHEJ介导的修复存在缺陷。评估mLncZFHX2fl/fl MCs中DNA损伤的彗星实验表明，Cre处理的MCs尾部力矩明显增加。免疫细胞化学进一步检测到Cre处理的mLncZFHX2fl/fl MCs中γH2AX阳性细胞的增加。此外，Cre转染的mLncZFHX2fl/fl MCs表现出较低的ECM沉积。

接下来，研究人员将mLncZFHX2fl/fl小鼠与Col2-CreERT2和ACAN-CreERT2小鼠杂交，生成了mLncZFHX2条件敲除(cKO)小鼠。结果显示DMM诱导的OA的mLncZFHX2 cKO小鼠骨赘形成增加。DMM手术后，mLncZFHX2fl/fl/Col2-CreERT2和mLncZFHX2fl/fl/ACAN-CreERT2小鼠软骨下骨重塑更严重。此外，假手术并未改变mLncZFHX2 cKO小鼠的形态，但DMM手术对cKO小鼠的软骨破坏更为严重。另外，免疫组织化学表明，在cKO小鼠的OA进展过程中，H2AX的磷酸化水平显著上调。