柯萨奇病毒B3（CVB3）是病毒性心肌炎的主要病原体之一，缺乏特定的抗病毒治疗选择。越来越多的证据表明，miR-17-92簇在病毒感染和心血管发育和疾病中都有重要作用，但其在CVB3诱导的病毒性心肌炎中的作用尚不清楚。近日，Antiviral Research期刊在线发表了一篇题为Cardiac miR-19a/19b was induced and hijacked by CVB3 to facilitate virus replication via targeting viral genomic RdRp-encoding region的研究论文。该研究表明，CVB3诱导的心脏miR-19a/19b通过促进病毒的生物合成和复制来促进病毒性心肌炎，暗示靶向miR-19a/19b可能是CVB3诱导的病毒性心肌炎的新治疗靶点。

 

 

研 究 结 果

 

1、心脏miR-19a/19b在CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠中显著上调

 

首先，研究人员让小鼠腹膜内感染CVB3，在感染后第3天，小鼠出现心脏炎症浸润和损伤，在第7天达到最大值，弥漫性单核细胞浸润和心肌损伤的存在证明了这一点。心脏病毒载量早在第3天达到最大值，此后逐渐下降。有趣的是，心脏miR-19a/19b的时间表达模式与miR-17-92簇的其他成员相反，其与心脏病毒载量的变化高度一致，但与炎症的严重程度无关，表明miR-19a/19b可能在CVB3感染和复制过程中发挥作用。

 

Fig1. 心肌miR-19a/19b在CVB3诱导的病毒性心肌炎中表达上调

 

 

2、过表达miR-19a/19b可显著促进感染心肌细胞中CVB3的生物合成

 

为了探索miR-17-92簇在CVB3感染中的潜在作用，研究人员用pmiR-17-92质粒转染小鼠HL-1心肌细胞。随后，将细胞再感染CVB3，并评估和比较CVB3基因组RNA的水平。结果发现，转染pmiR-17-92显著增加了HL-1细胞中miR-17-92的表达，导致感染后病毒载量显著增加，以及病毒RNA水平和衣壳VP1表达的增加。

 

进一步的研究发现，miR-17-92基因簇编码的6个成熟miRNAs中，只有miR-19a和miR-19b mimic表现出显著的病毒促进作用。与对照相比，在转染miR-19a或miR-19b mimic的细胞中观察到VP1蛋白和CVB3基因组RNA水平显著增加。结果表明，miR-19a和miR-19b在促进miR-17-92簇的促病毒作用中起着关键作用，其中miR-19b的作用更为显著。

 

Fig2. MiR-19a/19b上调感染心肌细胞中的CVB3生物合成

 

 

3、miR-19a/19b靶向病毒3Dpol编码区，增加病毒RNA稳定性

 

接着，研究人员使用生物信息学工具鉴定了miR-19a/19b的潜在靶标。结果显示，由于这两个 miRNAs 的种子序列（GUGCAA）相同，因此在CVB3基因组的RdRp 3Dpol编码区中发现了一个共同的假定结合位点。

 

为了验证miR-19a/19b通过靶向预测的3dpol编码序列促进CVB3生物合成的作用，研究人员使用pHA-3Dpol转染HeLa细胞，然后转染miR-19a/19b mimic，24 h后检测3Dpol的表达。结果发现，miR-19a/19b mimic在mRNA和蛋白质水平下均显著提高了3Dpol的表达；而对另一种病毒蛋白VP1的表达没有显著影响，进一步支持了miR-19a/19b选择性地靶向病毒RNA的3Dpol编码区域。CVB3基因组3Dpol编码区种子匹配序列的突变导致miR-19a/19b的促病毒作用消失也证明了这一点。

 

此外，研究人员还注意到，随着miR-19a/19b mimic的递增剂量，3Dpol mRNA的水平逐渐增加。miR-19a/19b对3Dpol mRNA转录的促进发生相对较晚，在miR-19a/19b mimic转染后12h开始，并持续到观察期结束。这表明miR-19a/19b可能不会直接影响3Dpol mRNA的从头合成，而是增强了生成的mRNA的稳定性。进一步的实验也证明了miR-19a/19b mimic有效延长了3Dpol mRNA的半衰期。

 

Fig3. MiR-19a/19b靶向3Dpol编码区域中CVB3的基因组RNA，从而提高3Dpol mRNA的稳定性

 

 

4、给药miR-19b agomir显著增加CVB3感染小鼠的心脏病毒载量并加剧病毒性心肌炎

 

接下来，研究人员在CVB3感染小鼠前一天通过尾静脉注射20nmol miR-19b agomir，然后监测心脏病毒载量和心肌炎严重程度。结果发现，接受miR-19b agomir治疗的小鼠表现出心脏miR-19b表达增加，心脏组织中CVB3基因组RNA水平显著升高。并在miR-19b agomir治疗的小鼠中观察到更严重的心肌炎，这反映在体重明显减轻，血清cTnI水平升高和心脏病理改变加重。

 

Fig4. 过表达miR-19b增加了感染小鼠的心脏病毒载量并加剧了病毒性心肌炎

 

 

5、转染miR-19b antagomir可显著降低感染细胞中的病毒生物发生和产生

 

随后，研究人员还探讨了阻断miR-19b对感染细胞中CVB3复制和产生的影响。结果发现，miR-19b antagomir在转录和翻译水平上明显降低了pHA-3Dpol转染细胞中的3Dpol表达。此外，转染miR-19b antagomir可显著降低感染率，并减少了病毒RNA的产生。以上结果表明，miR-19b antagomir有效地抑制了感染细胞中CVB3的复制和后代病毒的产生。

 

Fig5. 阻断miR-19b有效地减少了感染细胞中的病毒复制和后代病毒的产生

 

 

6、Anti-miR-19b治疗通过促进有效的病毒控制显著减轻了CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎

 

最后，研究人员在CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠中评估了miR-19b antagomir对anti-CVB3的疗效。小鼠在CVB3感染前一天静脉注射20nmol miR-19b antagomir，并评估心脏病毒载量和心肌炎严重程度。结果显示，给药miR-19b antagomir导致CVB3感染后心脏miR-19b表达降低，病毒RNA水平在心脏病毒载量峰值时（感染后第3天）显著降低，并持续下降至第5天。相应地，这种治疗导致心肌炎严重程度显著降低，感染后第7天体重仅下降14%，血清cTnI水平为62 pg/ml。组织学分析显示，miR-19b antagomir治疗的小鼠心肌损伤和心脏间质炎症较轻，心肌炎症仅约32%，明显低于NC对照小鼠。此外，这些小鼠的7天存活率为80%，高于对照组的50%。

 

Fig6. miR-19b antagomir体内治疗成功促进了病毒清除，缓解了CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎

 

 

研 究 结 论

 

总之，本研究结果表明，CVB3感染诱导小鼠心脏组织中miR-19a和miR-19b的上调，进而通过靶向3Dpol编码区域和增强CVB3基因组RNA的稳定性来促进病毒的生物合成和复制。一致地，在体外和体内给药miR-19b antagomir均能显著抑制CVB3的复制，并有效缓解CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎。本研究表明，阻断miR-19a/19b可作为治疗CVB3诱导的心肌炎的新治疗策略。

 

Fig7. 基于miR-19b的anti-CVB3治疗策略示意图

 

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0166354223001808?via%3Dihub

 

 

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