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JASN丨miR-147介导冷藏肾移植的线粒体功能障碍和肾小管损伤

人阅读发布时间：2023-07-03 11:28

冷藏相关移植（CST）引起的肾损伤是决定肾移植预后的一个主要因素，其中microRNAs的作用和调控在很大程度上仍然不清楚。近日，Journal of the American Society of Nephrology（IF14.978）发表了一篇题为miR-147 Represses NDUFA4, Inducing Mitochondrial Dysfunction and Tubular Damage in Cold-storage Kidney Transplantation的文章。该研究证明了microRNAs在CST损伤和移植物功能障碍中具有致病性，其中miR-147在CST肾脏中持续上调，并抑制NDUFA4，导致线粒体功能障碍和肾小管损伤。抑制miR-147和过表达NDUFA4可减轻CST损伤，暗示miR-147和NDUFA4是肾移植的新治疗靶点。

研究结果

1、近端肾小管Dicer缺失可保留移植物功能并减轻CST损伤

近端肾小管（PT）是移植相关性肾损伤的主要损伤部位。为了确定microRNAs的重要性，研究人员将PT-Dicer WT小鼠和PT-Dicer KO小鼠的肾脏冷藏，然后根据特征良好的冷藏/移植（CST）小鼠模型移植到WT受体中。结果发现，移植后1天，WT移植物表现为肾小管细胞丢失和坏死，外髓质和皮质明显形成管型，表明CST损伤，而Dicer-KO移植物显示出更好的肾脏组织学，小管溶解较少，TUNEL阳性细胞较少。在第7天，WT移植物有许多扩张的肾小管，而Dicer KO移植物没有。在第14天，WT移植物在组织学上显示修复，而KO移植物几乎完全恢复。在TUNEL染色中，KO移植物的凋亡细胞较少。

Fig1. 近端肾小管Dicer缺失可减轻CST损伤

为了检验移植肾的功能，研究人员让移植肾从最初的损伤中恢复6天，然后移除自体肾，使移植肾成为维持生命的排泄肾。结果发现，WT移植物小鼠在移除自体肾1天后血清肌酐和血尿素氮（BUN）明显升高，表明移植物功能障碍。相比之下，PT-Dicer-KO移植物小鼠的血清肌酐和BUN水平较低。此外，在移植后第1天，近端小管损伤的标志物KIM-1在WT移植物中显著增加，然后在第7天和第14天减少，可能是肾脏修复的结果。而在所有这些时间点，PT-Dicer-KO移植物显示较少的KIM-1阳性肾小管。Dicer是功能性microRNAs生物发生的关键酶，近端肾小管Dicer的缺失导致肾脏中的microRNA的缺失。因此，以上结果表明，近端肾小管中Dicer相关的microRNAs有助于CST损伤。

Fig2. 近端肾小管Dicer缺失可保留移植物功能

2、miR-147在CST肾脏和人DGF样本中升高

接着，研究人员进行了小RNA深度测序来分析CST小鼠肾脏中的microRNA表达。PCA分析显示对照和CST样本之间有明显的聚类分离。总共检测到505个已知的小鼠microRNAs，其中50个在CST后显著增加，而31个至少在第1天、第7天或第14天的一个时间点下降。火山图进一步显示了microRNAs的差异表达。与sham对照相比，在小RNA测序中，CST肾脏在所有时间点都显示出miR-147的强烈诱导。

Fig3. 肾脏冷藏移植后microRNA表达谱的变化

原位杂交检测到miR-147诱导主要在肾小管细胞的细胞质中，值得注意的是，诱导主要发生在CST肾的KIM-1阳性小管中。RT-PCR进一步证实了miR-147在WT移植物中的诱导作用，有趣的是，在Dicer-KO移植物中，miR-147的诱导作用被抑制。此外，研究人员通过原位杂交进一步分析了人类移植肾功能延迟恢复（DGF）患者的肾活检和癌旁正常肾组织。结果显示，miR-147在DGF样本肾小管细胞中的表达明显高于正常肾组织。总的来说，这些数据证明了CST损伤后miR-147在近端肾小管细胞中的诱导作用。

Fig4. miR-147在冷藏移植肾脏和人DGF样本中升高

3、Anti-miR-147改善移植物功能，减少移植物损伤和炎症

为了确定miR-147在CST损伤中的作用，研究人员测试了anti-miR-147（miR-147特异性antagomir）的作用。冷藏移植（CST）后立即通过尾静脉注射给予受体小鼠anti-miR-147或阴性对照oligo（NC）。结果显示，anti-miR-147显著降低了CST肾脏中miR-147的表达。值得注意的是，第6天取肾后，第7天明显升高。值得注意的是，anti-miR-147可以部分但显著地减少受体小鼠在移除自体肾后血清肌酐和BUN的增加。一致地，anti-miR-147减少了肾小管损伤和KIM-1染色。Anti-miR-147还抑制了移植物中的C3和巨噬细胞浸润，此外，anti-miR-147处理改善了CST移植物中线粒体结构的破坏。总之，这些结果表明anti-miR-147的保护作用，表明miR-147在CST损伤中的致病作用。

Fig5. Anti-miR-147改善移植物功能，减少移植物损伤和炎症

4、Anti-miR-147可防止肾小管细胞ATP损耗后的细胞死亡和线粒体功能障碍

为了了解miR-147如何介导CST损伤，研究人员检测了anti-miR-147对培养的肾近端小管细胞（RPTCs）中ATP损耗诱导的损伤的影响。用CCCP（一种氧化磷酸化抑制剂）对RPTCs进行3小时的ATP损耗，然后返回正常培养基进行2小时的恢复（CCCP-R），以模拟体内肾缺血/再灌注。结果发现，CCCP-R治疗导致细胞凋亡，它还诱导miR-147表达增加约2倍，anti-miR-147可以减弱这种表达。与NC相比，anti-miR-147在CCCP-R处理期间显著降低细胞死亡和caspase 3激活。重要的是，anti-miR-147阻止了线粒体膜电位的缺失。此外，CCCP-R处理减少了细胞ATP，而anti-miR-147可以维持细胞中的ATP。进一步的研究发现，CCCP-R显著降低了基础耗氧量和最大呼吸量，而anti-miR-147处理维持了这两项指标。anti-miR-147的保护作用提示miR-147可能通过诱导线粒体损伤介导肾小管细胞损伤和死亡。

Fig6. Anti-miR-147保护肾小管细胞ATP消耗后的细胞死亡和线粒体功能障碍

5、miR-147在肾移植和ATP消耗损伤过程中靶向NDUFA4

为了研究miR-147如何介导线粒体功能障碍和细胞死亡，研究人员试图鉴定出miR-147的靶基因。通过生信分析预测发现，NDUFA4是预测在CST损伤中诱导的基因，在NDUFA4 mRNA的3 ' UTR中发现了一个保守的miR-147靶向位点。随后的荧光素酶报告基因实验进一步证实了miR-147直接靶向NDUFA4-3'UTR。进一步的实验显示，CCCP-R处理导致NDUFA4表达下降， anti-miR-147可以阻止这种下降；相反，在CCCP-R处理期间，miR-147 mimic进一步抑制了NDUAF4。一致地，CST损伤显著降低了小鼠肾脏近端小管NDUFA4的表达，这种降低被anti-miR-147部分抑制，进一步证明了NDUFA4是miR-147在CST损伤中的靶标。

Fig7. miR-147在肾脏冷藏移植和ATP消耗损伤中靶向NDUFA4

6、NDUFA4在肾小管细胞ATP消耗损伤过程中维持线粒体功能和细胞活力

为了确定NDUFA4在miR-147介导的线粒体功能障碍中的作用，研究人员使用siRNA敲低NDUFA4表达。结果发现，与转染scrambled对照的细胞相比，CCCP-R处理会导致转染NDUFA4-siRNA的细胞出现更多的凋亡。CCCP-R处理后，NDUFA4-siRNA细胞也具有更多的裂解/活性caspase-3。相反，过表达NDUFA4则在CCCP-R处理期间阻止了细胞死亡和caspase活化，进一步支持NDUFA4对肾小管细胞的保护作用。

Fig8. NDUFA4在肾小管细胞ATP消耗损伤过程中维持线粒体功能和细胞活力

7、供体肾脏中的NDUFA4过表达可改善CST损伤

为了研究NDUFA4在CST损伤中的作用，研究人员通过原位转导含有NDUFA4（Ad-NDUFA4）或阴性对照序列（Ad-NC）的腺病毒载体，在供体肾脏中过表达NDUFA4。结果发现，Ad-NDUFA4转染的移植物比Ad-NC转染的移植物具有更好的肾功能和组织学。此外，Ad-NDUFA4转染的移植物也具有更少的TUNEL阳性细胞并维持更好的线粒体结构。