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IF12+客户文章丨锐博MeRIP-Seq助力揭示METTL3调节乳腺癌肿瘤发生和糖酵解的作用机制

人阅读发布时间：2023-02-27 10:17

肿瘤相关因子的转录后修饰在乳腺癌进展中起着关键作用。然而，潜在的机制仍然未知。癌细胞中的m6A修饰是动态和可逆的，并且已经发现通过各种机制影响肿瘤的发生和进展。近日，Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF12.658）期刊发表了题为The N6-methyladenosine METTL3 regulates tumorigenesis and glycolysis by mediating m6A methylation of the tumor suppressor LATS1 in breast cancer的研究论文，探讨了Hippo通路中m6A甲基化对乳腺癌细胞增殖和代谢的调控机制。结果发现METTL3-LATS1-YTHDF2通路通过激活Hippo通路中的YAP/TAZ在乳腺癌的进展中发挥重要作用。

• 乳腺癌中Hippo通路蛋白m6A甲基化水平异常

为了研究乳腺癌组织样本中的m6A修饰水平，研究人员对配对的乳腺导管癌组织和相邻的正常乳腺组织样本进行了MeRIP-seq。结果发现，癌症组织中存在大量差异甲基化或修饰的mRNAs。有超过一半的m6A特异性位点富集在肿瘤组织中，并出现在经典的mRNA修饰区域（即外显子，3'UTR和终止密码子）附近。差异表达的m6A基因和mRNAs的联合分析帮助研究人员发现了m6A修饰对mRNA表达、mRNA丰度和差异表达基因的影响。对这些差异表达基因的功能富集分析进一步揭示了m6A修饰在调节多种癌症和通路（如MAPK、Hippo和PI3K-Akt信号通路）中发挥重要作用。值得注意的是，研究人员发现Hippo通路中的基因在乳腺癌组织中被差异修饰和表达。

Hippo通路是参与癌症发展的重要增殖调节通路。结果表明，肿瘤抑制因子LATS1的m6A修饰可能参与mRNA表达的下调和细胞代谢过程的负调节。MeRIP-seq结果表明，LATS1 mRNA的m6A修饰水平在两个以上位点显著上调。为了确定乳腺癌中LATS1的m6A修饰机制，研究人员预测了LATS1 mRNA中的m6A位点，并预测出m6A writer蛋白mettl3为乳腺癌细胞m6A修饰过程中LATS1 mRNA的结合蛋白。

Fig1. m6A修饰mRNA的异常水平与乳腺癌的多种通路有关

• METTL3的表达可能是影响乳腺癌患者预后和促进乳腺癌细胞肿瘤发生的独立因素

为了研究METTL3在乳腺癌中的表达，研究人员检测了其在乳腺癌组织和配对的正常组织中的蛋白水平。结果显示，Mettl3在乳腺导管癌组织中高表达。IHC结果显示，Mettl3主要在癌组织的细胞质和细胞核中表达，少量在细胞膜上表达。Kaplan-Meier生存分析显示，高METTL3蛋白表达与浸润性导管癌和管腔乳腺癌组织的不良预后显著相关。

Fig2. 在乳腺癌组织中发现METTL3表达的变化

这些数据表明METTL3促进乳腺浸润性导管癌的发生。因此，研究人员通过敲除或过表达METTL3来检测其在乳腺肿瘤发生中的作用。结果显示，删除METTL3后，肿瘤细胞增殖和存活明显受到抑制，并且缺失METTL3抑制了乳腺癌细胞的迁移和侵袭。在免疫缺陷小鼠中，敲除METTL3可以抑制相应细胞形成肿瘤的生长，而过表达METTL3则可以显著促进移植瘤的生长。证实了METTL3在乳腺癌肿瘤发生中的重要作用。

Fig3. METTL3在体外和体内均促进乳腺癌细胞MCF-7的肿瘤发生

• METTL3通过调控LATS1 mRNA m6A修饰影响乳腺癌细胞代谢

为了研究METTL3对MCF-7细胞转录组表达的影响，研究人员进行了RNA-Seq。结果显示，METTL3表达显著增加了2845个转录本，减少了2044个转录本的表达。KEGG分析显示，Hippo通路和糖酵解与METTL3表达显著相关。此外，对差异表达基因的通路富集分析表明，METTL3与乳腺癌和Hippo通路显著相关。代谢组测序结果显示METTL3的表达参与了癌症的中心碳代谢，特别是糖酵解和糖异生。

Fig4. METTL3影响乳腺癌细胞的Hippo途径和糖酵解

为了了解METTL3促进乳腺癌糖酵解的机制，研究人员评估了METTL3对MCF-7和T47D细胞糖酵解的影响。结果发现，METTL3的缺失降低了乳腺癌细胞系的糖酵解活性。通过RNA pull-down实验和western blotting，研究人员证实了LATS1 mRNA和METTL3之间的相互作用。MeRIP-qPCR结果表明，METTL3的存在直接增加了LATS1 mRNA的m6A水平，进一步证实了METTL3的调控介导了LATS1 mRNA的m6A甲基化。为了研究m6A调控对乳腺癌细胞增殖和糖酵解的影响，研究人员进行了集落形成实验。结果表明，METTL3敲除后抑制LATS1可以挽救乳腺癌细胞的增殖。此外，海马测定显示，在乳腺癌细胞中METTL3表达缺失后，当LATS1表达被抑制时，糖酵解被上调。

Fig5. METTL3促进乳腺癌细胞的糖酵解和集落形成能力

• 通过乳腺癌细胞中的ythdf2鉴定LATS1 mRNA的M6A调控

由于MeRIP-seq发现LATS1 mRNA有较高的m6A修饰水平，研究人员想要确定哪些m6A reader可以直接识别m6A修饰位点并调节乳腺癌细胞中LATS1的表达。LATS1 mRNA的稳定性实验表明，缺失METTL3促进了mRNA的稳定性，而突变LATS1 mRNA中的m6A位点也增强了这种稳定性。RNA pull-down和western blotting实验发现，YTHDF2是LATS1 mRNA的m6A reader。此外，研究人员发现METTL3的表达对m6A eraser FTO和m6A reader YTHDF2的表达没有影响。而LATS1蛋白水平与YTHDF2在乳腺癌细胞中的表达呈负相关。

Fig6. 通过乳腺癌细胞中的ythdf2鉴定LATS1 mRNA的M6A调控

为了确定YTHDF2在乳腺癌细胞中的影响并了解其在肿瘤发生和糖酵解中LATS1 mRNA的m6A甲基化中的作用，研究人员改变了YTHDF2在乳腺癌细胞中的表达。结果发现LATS1的m6A甲基化下调了乳腺癌细胞中LATS1的表达，并通过抑制其磷酸化激活YAP/TAZ。诱导METTL3表达后，乳腺癌细胞核中YAP/TAZ水平较高，而YTHDF2的表达缺失可以纠正细胞核中的这种偏移表达。海马测定表明，YTHDF2对乳腺癌细胞的糖酵解有积极作用。YTHDF2在乳腺癌细胞中的表达促进了体外和体内的肿瘤发生。进一步的实验发现，YTHDF2的缺失抑制了肿瘤的增殖、生存和侵袭，而这种肿瘤抑制作用通过抑制LATS1的表达得以恢复。