产品简介

真核生物mRNA的5’端帽子结构和3’端 poly(A)尾是mRNA的必要结构元件，对mRNA在体内或细胞内的稳定性、翻译效率及免疫原性有重大影响。传统的mRNA体外合成一般需要先转录、再进行加帽和加尾，步骤较为繁琐。本试剂盒可使用含有T7启动子序列、AGG起始序列、mRNA编码序列和poly(A)尾序列的DNA模板进行体外转录反应，一步反应即可合成带有帽结构类似物Ribo-Cap1和poly(A)尾的成熟mRNA，大大简化体外制备mRNA的反应和质控检测步骤，并能获得更高的加帽率和转录效率。此方法合成的mRNA能够减低RNA产生先天性免疫反应，可用于显微注射、转染、体外翻译、mRNA疫苗临床前研究等下游应用。

 

产品组分及运输保存

本试剂盒为低温运输，收到产品后，请于-20℃保存，按照要求条件储存，可稳定保存一年。

 

表1. 试剂盒组分

试剂	C11080-1	C11080-2	保存条件
T7 RNA Polymerase Mix	40 μL	400 μL	-20℃
5× T7 Reaction Buffer	80 μL	800 μL	-20℃
2× NTP/Ribo-Cap1 Mix	200 μL	1 mL × 2	-20℃
Control DNA Template (0.5 μg/μL)	10 μL	100 μL	-20℃
DNaseI (RNase-free) (1 U/μL)	20 μL	200 μL	-20℃
LiCl Solution (7.5 M LiCl, 10 mM EDTA)	400 μL	1 mL × 4	-20℃

注：
1）2× NTP/Ribo-Cap1 Mix含ATP、UTP、CTP、GTP四种三磷酸核苷及Ribo-Cap1帽子结构类似物，其中4种三磷酸核苷的浓度均为15 mM，Ribo-Cap1帽子结构类似物的浓度为20 mM；

2）Control DNA Template作为模板进可转录产生长度约为1000 nt的mRNA。

 

使用前须知

1） 所有操作请严格遵循DNA和RNA操作要求，包括但不限于适用于DNA和RNA实验操作的实验环境、实验材料试剂及实验仪器。实验过程中，5×T7 Reaction Buffer置于室温备用，其它试剂请于实验前放置冰上备用，所有试剂使用完毕后需尽快于-20℃小心保存。

2） 需自行制备含有T7启动子序列、AGG起始序列、mRNA编码序列和poly(A)尾序列的线性DNA模板，基本结构见图1体外转录模板结构示意图。建议使用高纯度的平末端或5’突出的线性化质粒作为体外转录模板。

3） 若需要合成含修饰核苷的mRNA，需另外准备相应的核苷三磷酸试剂。

4） 必要时可使用试剂盒中的Control DNA Template作为阳性对照模板进行体外转录反应以明确体外转录反应的产出、产物检测等是否正常。

5） 使用过程请佩戴一次性手套等防护用品。

6）本试剂盒仅供科研和药物早期开发使用，不可用于体外诊断或治疗。

 

图1 体外转录模板结构示意图

 

材料及仪器准备

1） 体外转录DNA模板

2） 常规核苷三磷酸、修饰核苷三磷酸试剂及Ribo-Cap1试剂（需要合成含修饰核苷的mRNA时）

3） 75%乙醇

4） 无酶水

5） 恒温混匀仪或PCR仪等恒温反应设备

6） 台式高速冷冻离心机

7） RNA ladder

8） RNA检测试剂和设备，如微量紫外分光光度计或核酸定量检测荧光计、变性凝胶电泳试剂及设备等

9） RNA回收试剂、纯化试剂盒或纯化柱（可选）

 

使用方法

1.  mRNA合成

1.1.  将5× T7 Reaction Buffer和2× NTP/Ribo-Cap1 Mix置于室温下解冻，振荡混匀后2× NTP/Ribo-Cap1 Mix置于冰上备用，5× T7 Reaction Buffer置于室温下备用；T7 RNA Polymerase Mix不需解冻，使用时直接从-20℃取出使用或置于冰上备用。所有试剂需混匀后瞬时离心收集于管底再开盖使用，按表2配制20 μL转录体系：

 

表2 mRNA体外转录反应体系

组分	用量
5× T7 Reaction Buffer	4 μL
2× NTP/Ribo-Cap1 Mix	10 μL
Template DNA	1 μg
T7 RNA Polymerase Mix	2 μL
Nuclease-free Water	Add to 20 μL

 

1.2.  充分混匀，短暂离心。然后将反应体系置于37℃下反应4小时。

1.3.  去除DNA模板：在反应体系中加入1 μL DNase I（使用时从-20℃取出使用或置于冰上备用），混匀后继续于37℃反应15-30分钟。若体外转录反应模板量有调整，DNase I用量也需相应调整，每微克DNA模板对应1单位DNase I。

注意事项

1）请于室温下配制体系，5× T7 Reaction Buffer在低温下会引起DNA模板沉淀；

2）若5× T7 Reaction Buffer出现白色沉淀，请于37℃温育并振荡，直至沉淀溶解；

3）300-5000 nt长度的转录本一般在2-4h便达到最大产量。但对于短转录本（<300 nt），转录时间建议增至6-8个小时。

 

2.  RNA产物纯化回收

体外合成的mRNA可用多种方法纯化回收，本试剂盒提供氯化锂沉淀试剂，可方便快捷地去除大部分未结合的核苷酸单体及酶类，且不引入具有毒性的有机溶剂，适用于显微注射、转染、体外翻译等下游应用。

 

2.1.  请提前解冻LiCl Solution (7.5 M LiCl, 10 mM EDTA)。在反应液中补加20 μl无酶水，然后加入20 μl的LiCl Solution (7.5 M LiCl, 10 mM EDTA)，混匀。

2.2.  置于-20℃至少30分钟。

2.3.  4℃，12000 rpm离心15-30分钟。

2.4.  小心移除上清液，加入500 μL预冷的75%乙醇，12000 rpm离心10分钟。

2.5.  重复2.4洗涤RNA沉淀一次。

2.6.  于12000 rpm下短暂离心1分钟，用移液枪小心移除残留的液体。

2.7.  室温干燥RNA沉淀，用Nuclease-free Water复溶RNA沉淀。

2.8.  置于-20℃~-80℃保存。

注意事项

1）若反应体系有调整，则在反应液中补加等体积的无酶水，再加入补水后1/2体积的LiCl Solution (7.5 M LiCl, 10 mM EDTA)；

2） LiCl沉淀法不适用于长度小于300 nt或浓度低于0.1 mg/mL的RNA纯化回收，若mRNA长度小于300 nt或RNA浓度低于0.1 mg/mL， 建议使用chloroform法或其它方法纯化回收RNA产物。

 

3.  RNA产物检测

本试剂盒转录产物可用多种核酸检测方法检测mRNA的产量和质量，包括使用紫外分光光度计或荧光计等检测核酸产物的浓度，使用变性凝胶电泳或毛细管电泳等检测mRNA的长度和完整性等，具体请参考相关检测方法和仪器的说明。

 

相关产品

 

表3 相关产品

产品编号	保存条件
C11081-1mL/10mL/100mL	ATP(100 mM)，1/10/100 mL
C11082-1mL/10mL/100mL	UTP(100 mM)，1/10/100 mL
C11083-1mL/10mL/100mL	CTP(100 mM)，1/10/100 mL
C11083-1mL/10mL/100mL	GTP(100 mM)，1/10/100 mL
C11085-1mL/10mL/100mL	5-Me-CTP(100 mM)，1/10/100 mL
C11086-1mL/10mL/100mL	5-OMe-UTP(100 mM)，1/10/100 mL
C11087-1mL/10mL/100mL	Pseudo-UTP(100 mM)，1/10/100 mL
C11088-1mL/10mL/100mL	N1-Me-Pseudo-UTP(100 mM)，1/10/100 mL
C11089-1mL/10mL/100mL	Ribo-Cap1(500 mM)，1/10/100 mL
C11090-1mL/10mL/100mL	T7 RNA Polymerase Mix，1/10/100 mL
C11091-2mL/20mL/200mL	5× T7 Reaction Buffer，2/20/200 mL
C11092-1mL/10mL/100mL	DNaseI (RNase-free) (1 U/μL)，1/10/100 mL

 

FAQ

1. 如何检测转录产物的质量？

1） RNA产物浓度：使用紫外分光光度计检测RNA样品的A260以计算RNA溶液的浓度，该方法可能受到样品中残留的未结合核苷酸和DNA模板的影响。若使用有机溶剂抽提法进行了RNA的回收，残留的酚类物质也可能会影响样品浓度的准确定量；另外可使用核酸荧光定量法检测RNA溶液浓度，相比于紫外吸收法，该法的灵敏度更高和特异性更好，不受样品中游离核苷酸或非常短的寡核苷酸的影响。需注意的是，修饰核苷可能会影响A260及荧光定量法检测而造成结果偏差。

2） RNA产物长度及完整性：使用变性琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳或其他电泳系统检测RNA产物的长度和完整性，不建议使用非变性凝胶电泳检测RNA长度和完整性，受RNA二级结构影响，非变性凝胶电泳不能准确反映RNA的长度。

 

2. 体外转录mRNA的产率一般是多少？

mRNA的产率跟RNA序列长度、序列组成、模板用量、模板质量等都有关系，若以本试剂盒阳性对照模板为体外转录模板，本试剂盒一个标准反应体系一般可产出70-150 ug的mRNA。

 

3. 是否可放大或缩小反应体系？

如需要放大反应体系，可等比调整反应体系各试剂的用量。需注意使用合适的恒温反应仪器和无核酸酶的离心管、PCR管或其他反应器。

 

4. RNA产率不足的可能原因及解决方法。

可能的原因及解决方法包括：

1）DNA模板的质量：无论是使用质粒线性化还是PCR方式来制备模板，均应经过纯化后再用于转录，建议用琼脂糖凝胶电泳检测模板条带是否单一，并严格检测其浓度及纯度。可使用试剂盒中的Control DNA Template作为模板进行相同条件的反应以确定是否体外转录模板存在问题。

2）长度小于300 nt的RNA体外转录，建议增加模板量至每个反应2ug并延长转录时间至6-8个小时，甚至过夜转录来一定程度提高RNA的产量。

3）转录产物出现降解：可能是DNA模板或者试剂、耗材存在RNase污染。请确保使用无RNase污染的试剂耗材。如果是模板存在RNase污染，建议使用Phenol:chloroform: isoamyl alcohol25:24:1（PH≥7.8）试剂重新回收纯化DNA模板，并严格检测其质量和浓度。

 

5. polyA长度多长合适？

polyA长度间接调节mRNA的翻译和半衰期，研究证明100nt以上的polyA序列可增加mRNA稳定性，提高翻译效率。我们建议的polyA长度为100-150nt。

 

6. 是否可使用这个试剂盒合成修饰mRNA？

1）需要另外准备相应的常规核苷三磷酸和修饰核苷的核苷三磷酸试剂，以及帽子结构类似物Ribo-Cap1试剂。

2）体外转录反应中的ATP、UTP、CTP、GTP终浓度为7.5 mM。当需要制备修饰核苷的mRNA时，可使用修饰核苷的核苷三磷酸等量替换对应的常规核苷三磷酸进行体外转录反应。

 

订购信息

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产品编号	产品名称	规格	目录价
C11080-1	Ribo™ T7 mRNA Transcription Kit	20T	¥5680

 

自新品发布之日起-9月30日，凡是在锐博生物在线平台下单订购T7共转录RNA合成试剂盒，即可享受新品发布活动价4544元！