真核生物mRNA的5’端帽子结构（5’-Cap）和3’端poly(A)尾是mRNA有效翻译的必要结构元件，对mRNA在体内或细胞内的稳定性、翻译效率及免疫原性有重大影响。

 

mRNA结构元件

 

5'-Cap结构可防止mRNA被核酸外切酶降解，从而维持mRNA的稳定性并使翻译起始。根据甲基化程度的不同，目前主要存在3种类型的帽结构：Cap0、Cap1和Cap2。

 

• Cap0结构是最基本的，即m7GpppNp；然而，Cap0 mRNA很可能被宿主识别为外源性RNA，这可能会刺激宿主的先天免疫反应并最终引发炎症反应。

• Cap1结构（m7GpppN1mp）：即mRNA的5'端连接到Cap的第一个核苷酸上的2'-OH被甲基化。由于Cap1结构迄今为止仅在真核mRNAs中被描述，因此它可以作为self-RNA的标记，从而减少模式识别受体(PRR)的激活，提高mRNA在体内的翻译效率。目前，Cap1结构最常用于加帽mRNA疫苗。

• Cap2（m7GpppN1mpN2mp）：即mRNA的5'端连接到Cap的第一个和第二个核苷酸上的2'-OH均被甲基化，甲基化提高了mRNA的翻译效率。

 

mRNA帽子结构

 

在mRNA的IVT过程中，主要有两种类型的加帽方法：

 

第一种方法是使用一种加帽酶RTPase（RNA 5'-三磷酸酶），它水解RNA转录本的5'γ-磷酸，通过鸟苷酸转移酶（GTase）将鸟苷一磷酸（GMP）转移到5'-二磷酸RNA，然后得到的5'-末端β-磷酸与GMP结合形成GpppNp-RNA。最后，鸟苷部分被帽特异性S-腺苷甲硫氨酸（AdoMet）依赖性（鸟嘌呤-N7）甲基转移酶（N7MTase）甲基化，形成Cap0结构（m7GpppNp）。Cap0结构可以通过2'-O-甲基转移酶（2'-O-MTase）进一步修饰为Cap1（m7GpppN1mp）。牛痘加帽酶（VCE）整合了RTPase、GTase和G-N7 MTase的酶活性，可以加帽生成Cap0结构，然后使用2'-O-MTase生成甲基化的Cap1结构。其缺点为制备工艺复杂繁琐，不适用于扩大生产。

 

使用加帽酶的mRNA加帽流程

 

第二种加帽方法是在mRNA转录过程中使用帽类似物（m7GpppG），涉及T7、T3或SP6 RNA聚合酶来实现mRNA的共转录加帽。共转录加帽是mRNA IVT中最常用的方法，但研究发现帽类似物以相反的方向结合mRNA链。反向加帽的mRNA不能被核糖体识别，导致翻译效率降低。为了避免反向加帽，mRNA疫苗开发过程中一般采用具有甲基化修饰的修饰帽类似物来进行共转录加帽。

 

使用帽类似物（Ribo-Cap1）的mRNA加帽流程

 

为了解决传统mRNA制备步骤繁琐的问题，锐博生物重磅推出了Ribo™ T7 mRNA转录试剂盒，该试剂盒可利用含有T7启动子序列、AG起始序列和poly(A)尾编码区的DNA模板，在转录过程中掺入合成的帽结构类似物Ribo-Cap1，一步完成成熟mRNA的制备。合成的mRNA能够被有效翻译并能逃避细胞先天免疫反应。

 

Ribo™ T7 mRNA转录试剂盒

 

此外，本试剂盒还可根据需求对单个或多个核苷酸单体进行替换，制备特殊化学修饰的mRNA。转录合成的mRNA可用于显微注射、转染、体外翻译、mRNA疫苗临床前研究等下游应用。

 

Ribo™ T7 mRNA转录流程

 

试剂盒组成

试剂	C11080-1	C11080-2	保存条件
T7 RNA Polymerase Mix	40 μL	400 μL	-20℃
5× T7 Reaction Buffer	80 μL	800 μL	-20℃
2× NTP/Ribo-Cap1 Mix	200 μL	1 mL × 2	-20℃
Control DNA Template (0.5 μg/μL)	10 μL	100 μL	-20℃
DNaseI (RNase-free) (1 U/μL)	20 μL	200 μL	-20℃
LiCl Solution (7.5 M LiCl, 10 mM EDTA)	400 μL	1 mL × 4	-20℃

注：
1）2× NTP/Ribo-Cap1 Mix含ATP、UTP、CTP、GTP四种三磷酸核苷及Ribo-Cap1帽子结构类似物，其中4种三磷酸核苷的浓度均为15 mM，Ribo-Cap1帽子结构类似物的浓度为20 mM；

2）Control DNA Template作为模板进可转录产生长度约为1000 nt的mRNA。

 

产品特点及优势

 

• 操作简便：采用帽结构类似物Ribo-Cap1，仅需一步共转录加帽即可完成Cap1 mRNA的合成

• 加帽率高：一步法共转录产物的加帽率可稳定在90%以上

• 产量高：与抗反帽ARCA相比，Ribo-cap1与GTP无竞争，不影响RNA的产率，针对长度300-5000nt的转录本，1μg模板投入量可产生70-150μg的mRNA

• 表达效率高：带有天然Cap1帽的mRNA相较于Cap0帽修饰在真核生物中具有更高的表达效率，并可减少先天免疫刺激

 

产品结果示例

 

示例1：使用Ribo™ T7 mRNA转录试剂盒合成长度1300nt的mRNA，并检测mRNA的完整性及大小。结果显示在1000-2000nt处出现了明显的条带，检测到合成的mRNA大小为1312nt。

 

mRNA完整性及大小分析

 

示例2：使用Ribo™ T7 mRNA转录试剂盒合成长度为4000nt的mRNA，20μL反应体系中加入1μg DNA模板，并检测不同时间点的mRNA产量。结果显示反应时间在2h时，mRNA的产量达到峰值。

 

mRNA合成时间累积曲线

 

示例3：使用帽类似物Ribo-Cap1加帽，并通过高效液相色谱分析mRNA的加帽率。结果显示使用Ribo-Cap1共转录加帽生成的mRNA，其加帽率达到96%。

 

mRNA加帽率分析

 

产品订购信息

 

登陆锐博生物24h在线订购平台www.ribobio.com，搜索以下产品编号或产品名称，加入购物车即可下单购买啦！锐博在线平台专为广大科研工作者提供及时、贴心、专业、优质的核酸产品或服务，让每一个科研人员省心、放心，为每一个科学研究保驾护航！

 

产品名称	产品名称	规格	规格
C11080-1	Ribo™ T7 mRNA Transcription Kit	20T	¥5680

 

自新品发布之日起-9月30日，凡是在锐博生物在线平台下单订购T7共转录RNA合成试剂盒，即享受新品发布活动价4544元！

 

相关产品

 

使用Ribo™ T7 mRNA转录试剂盒还可合成修饰mRNA，只需要另外准备相应的常规三磷酸核苷和修饰核苷的三磷酸核苷试剂，以及帽子结构类似物Ribo-Cap1试剂，替换试剂盒中的2× rNTP/Ribo-Cap1 Mix即可。体外转录反应中的rATP、rUTP、rCTP、rGTP终浓度为7.5 mM，帽子结构类似物Ribo-Cap1的终浓度为10 mM。当需要制备修饰核苷的mRNA时，可使用修饰核苷的三磷酸核苷等量替换对应的常规三磷酸核苷进行体外转录反应。

 

产品编号	产品名称
C11081-1mL/10mL/100mL	ATP(100 mM)，1/10/100 mL
C11082-1mL/10mL/100mL	UTP(100 mM)，1/10/100 mL
C11083-1mL/10mL/100mL	CTP(100 mM)，1/10/100 mL
C11084-1mL/10mL/100mL	GTP(100 mM)，1/10/100 mL
C11085-1mL/10mL/100mL	5-Me-CTP(100 mM)，1/10/100 mL
C11086-1mL/10mL/100mL	5-OMe-UTP(100 mM)，1/10/100 mL
C11087-1mL/10mL/100mL	Pseudo-UTP(100 mM)，1/10/100 mL
C11088-1mL/10mL/100mL	N1-Me-Pseudo-UTP(100 mM)，1/10/100 mL
C11089-1mL/10mL/100mL	Ribo-Cap1(500 mM)，1/10/100 mL
C11090-1mL/10mL/100mL	T7 RNA Polymerase Mix，1/10/100 mL
C11091-2mL/20mL/200mL	5× T7 Reaction Buffer，2/20/200 mL
C11092-1mL/10mL/100mL	DNaseI (RNase-free) (1 U/μL)，1/10/100 mL

 

更多产品信息欢迎登陆锐博生物官网（www.ribobio.com）进行查询！