N6-甲基腺嘌呤（m6A）是最主要的RNA修饰，已被证明与多种癌症有关。然而，对其在前列腺癌（PCa）中的作用在很大程度上仍然是未知的。近日， Nature子刊Cell Death Discovery期刊上发表了题为METTL14 promotes prostate tumorigenesis by inhibiting THBS1 via an m6A-YTHDF2-dependent mechanism的研究论文。文章报道了METTL14的上调与PCa患者预后不良相关，揭示了METTL14通过m6A-YTHDF2依赖性方式抑制THBS1表达，从而充当癌基因的作用机制。暗示METTL14可能是一个潜在的预后标志物和治疗靶点。
研究结果：

• METTL14的上调与PCa患者预后不良相关
为了量化PCa患者中METTL14的表达，研究人员对包含前列腺肿瘤组织样本（n=49）和相邻正常前列腺组织样本（n=11）的组织微阵列进行了IHC染色。结果显示METTL14在PCa组织中高表达。类似地，在人类PCa细胞系中观察到METTL14 mRNA和蛋白质的高表达水平。此外，研究人员测量了正常和PCa肿瘤细胞系的相对m6A定量。发现PCa肿瘤细胞系表现出比正常细胞更高的m6A水平，并且敲低METTL14可降低PCa细胞系中的m6A水平。

临床分析显示，METTL14高表达的PCa患者表现出更短的总生存期（OS）。随后，研究人员分析了PCa TCGA数据集，以发现m6A水平与PCa患者预后之间的关联，结果显示m6A水平高的患者，其OS较差，提示高m6A水平是不良预后因素。表明METTL14表达上调通过介导m6A修饰影响PCa患者的预后。
• METTL14在体外和体内促进PCa细胞增殖
为了探索METTL14在PCa中的作用，研究人员建立了稳定的METTL14敲低和过表达细胞系。结果发现METTL14的缺失显著降低了细胞增殖和集落形成效率；而过表达METTL14则会增加肿瘤细胞的增殖和集落数量。此外，细胞周期检测显示，METTL14敲低细胞系中，G2期细胞比例增加，S期细胞比例降低；而METTL14表达升高可有效降低G2期细胞比例，并增加S期细胞的比例。进一步证实了METTL14对细胞增殖的作用。体内实验显示METTL14的缺失显著限制了肿瘤的生长。与对照组相比，shMETTL14组的肿瘤体积和重量更小。表明METTL14可导致PCa细胞增殖加速。
• 通过RNA-seq和MeRIP-seq鉴定METTL14靶标
为了进一步探索METTL14促进肿瘤进展的机制并确定其在PCa中的下游靶标，研究人员使用shNC和shMETTL14 DU145细胞进行了RNA-seq和MeRIP-seq（由锐博生物提供测序服务）。RNA-seq分析显示， METTL14敲低的肿瘤细胞中分别有204个基因下调，172个基因上调。GO分析发现差异基因与mRNA稳定性调节、细胞周期G2/M相变、结合正调节和RNA转运有关。
MeRIP-seq分析显示，GGAC是检测到的peaks峰中最常见的m6A motif。总的来说，MeRIP-seq分析分别在shNC和shMETTL14细胞中鉴定出5461个和2861个peaks峰。此外，m6A信号在3' UTR中大量富集。为了评估基因表达的改变是否是由m6A修饰引起的，研究人员将MeRIP-seq中282个减少的m6A峰和RNA-seq中377个改变的基因重叠，发现11个基因都被检测到。其中内源性血管生成抑制因子THBS1表现出最一致的m6A水平下降，其mRNA水平在shMETTL14 PCa细胞中较对照组升高。因此，选择THBS1作为METTL14 m6A修饰后的潜在靶基因进行进一步研究。
• THBS1受METTL14介导的m6A修饰调控
为了验证THBS1是否是METTL14介导的m6A修饰的靶标，研究人员在PCa细胞中进行了MeRIP-qPCR。结果显示，METTL14敲低时，THBS1的m6A富集显著降低。此外，THBS1 mRNA和蛋白质水平在PCa METTL14敲低细胞中均增加。免疫荧光检测显示METTL14蛋白定位于细胞核，THBS1蛋白定位于细胞质，敲低METTL14后，PCa细胞中THBS1的表达增加。此外，在用转录抑制剂actinomycin D处理培养物后，THBS1 RNA的半衰期在METTL14敲低细胞中得以延长。表明METTL14通过m6A依赖性方式介导mRNA降解以抑制THBS1表达。进一步的研究发现，敲低THBS1导致PCa细胞的生长增加，并且显著促进肿瘤细胞集落形成能力。表明THBS1可能作为抑制PCa增殖的潜在肿瘤抑制因子。
• YTHDF2以m6A依赖性方式促进THBS1 mRNA衰变
m6A writers添加的m6A甲基化需要m6A readers识别以增加或减少基因表达。其中，已知YTHDF2是促进mRNA降解的调节因子，可能被METTL14募集以介导THBS1 mRNA衰变。为了验证这一猜想，研究人员首先进行了RIP分析，以评估YTHDF2是否可以直接与THBS1 mRNA结合。结果显示，在PCa细胞中，抗YTHDF2抗体组比抗IgG抗体组结合更多的THBS1 mRNA。当METTL14被抑制时，YTHDF2与THBS1的结合减弱。为了进一步检查YTHDF2与THBS1 mRNA结合对其表达水平的影响，研究人员使用siRNA敲低YTHDF2，发现THBS1 mRNA和蛋白质表达水平均升高。此外，RNA稳定性分析显示，敲低YTHDF2后，THBS1的衰减率表现出明显放缓的趋势。表明YTHDF2能够识别METTL14甲基化的THBS1 mRNA，并加速THBS1 mRNA的衰变。

原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41420-022-00939-0

本研究中使用到的m6A甲基化RNA免疫沉淀试剂盒（货号：C11051-1）和MeRIP-seq测序服务均由锐博生物提供！更多产品与服务信息，欢迎来电咨询！