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APSB（IF14+）丨抑制miR-429-3p可有效改善AD模型小鼠的认知和突触功能

人阅读发布时间：2023-11-21 14:05

阿尔茨海默病（AD）是老年人痴呆症的主要原因。丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1（MKP-1）在AD中起神经保护作用。然而，MKP-1对AD影响的分子机制尚未得到广泛研究。MicroRNAs（miRNAs）在转录后水平调节基因表达，从而抑制mRNA翻译。近日，Acta Pharmaceutica Sinica B期刊（IF14.5）在线发表了一篇题为miR-429-3p mediates memory decline by targeting MKP-1 to reduce surface GluA1-containing AMPA receptors in a mouse model of Alzheimer's disease的研究论文。该研究报道了一个在APP23/PS45 AD模型小鼠大脑和N2AAPP AD模型细胞中显著增加的microRNA-429-3p (miR-429-3p)，其通过靶向MKP-1以减少AD小鼠模型中表面含有GluA1的AMPA受体，从而介导记忆力下降，提示miR-429/MKP-1通路可能是AD治疗的新靶点。

研究结果

1、miR-429-3p在AD中的表达异常升高，并通过直接靶向MKP-1来抑制其表达

研究发现，MKP-1在AD模型小鼠的大脑和AD模型细胞中下调。此外，Mkp-1包含一个长 3′UTR，提示可能受到miRNAs的负调控。为了鉴定调控MKP-1表达的潜在miRNAs，研究人员首先预测了Mkp-1表达相关的miRNAs，包括miR-429-3p、miR-200b/c-3p、miR-101a/b-3p、miR-137-3p、miR-152-3p、miR-92a-3p、miR-133a/b-3p和miR-133c。随后通过qRT-PCR检测了MKP-1表达相关miRNAs在AD模型小鼠大脑中的表达谱。结果发现miR-429-3p、 miR-200b-3p和miR-200c-3p在AD模型小鼠中显著升高，但在N2AAPP细胞中仅观察到miR-429-3p的增加。在Aβ42处理的原代培养神经元中也观察到miR-429-3p的增加。

接下来，研究人员通过荧光素酶报告基因实验以确定Mkp-1是否是这些miRNAs的直接靶标。结果显示，过表达miR-429-3p可显著抑制WT Mkp-1 3' UTR（而不是Mut Mkp-1 3′ UTR）的报告基因活性，过表达miR-200b-3p和miR-200c-3p得到同样的结果。为了阐明这些miRNAs是否可以调节MKP-1的蛋白水平，研究人员随后将miRNA mimics转染到N2A细胞中。结果发现，过表达miR-429-3p，而不是miR-200b-3p或miR-200c-3p，显著降低了MKP-1蛋白水平，但不改变Mkp-1 mRNA水平。为了进一步检测这些miRNAs在AD中调节MKP-1的作用，研究人员将miRNA antagomir或NC转染到N2AAPP细胞中。结果显示，miR-429-3p antagomir（A-miR-429）上调了MKP-1蛋白的表达，而miR-200b-3p和miR-200c-3p antagomir则没有。此外，A-miR-429显著增加了WT Mkp-1 3'UTR的荧光素酶活性。以上结果表明，只有miR-429-3p可以直接靶向Mkp-1 mRNA以抑制其翻译。因此，本研究主要关注miR-429-3p在AD中的可能作用。

Fig1. miR-429-3p在AD中异常升高，并通过直接结合MKP-1 mRNA抑制MKP-1的表达

2、抑制miR-429-3p可减少APP淀粉样蛋白沉积过程

接下来，研究人员探索了miR-429-3p是否影响APP过程。结果发现，过表达miR-429-3p可上调APP蛋白水平，但不影响BACE1蛋白水平；而使用A-miR-429抑制miR-429-3p则下调了APP、BACE1和PS1的蛋白水平，但A-miR-429不能改变Mkp-1-/-细胞中APP、BACE1和PS1的蛋白水平。

为了进一步阐明miR-429-3p在体内AD发病机制中的作用，研究人员通过鼻内给药将CY3标记的A-miR-429递送到AD模型小鼠体内。结果发现A-miR-429降低了miR-429-3p在AD模型中的表达水平，并挽救了AD模型小鼠神经元（而不是星形胶质细胞）中MKP-1蛋白水平的显著降低。同样的，A-miR-429治疗可使AD模型小鼠大脑中MKP-1的表达恢复到对照水平。此外，A-miR-429治疗导致AD模型小鼠大脑中BACE1和CTF水平显著降低，但APP和PS1水平没有降低。为了确定miR-429-3p是否影响AD相关的神经病理学，研究人员检测了老年斑的形成。结果发现，A-miR-429治疗可显著减少AD模型小鼠海马体中老年斑的数量，以及老年斑的面积。以上结果表明，A-miR-429抑制APP23/PS45 AD模型小鼠的APP淀粉样蛋白沉积过程和老年斑形成。

Fig2. miR-429-3p对APP淀粉样蛋白沉积过程的影响

3、抑制miR-429-3p通过减少GluA1 S831过度磷酸化来增加表面GluA1

最近的研究表明MKP-1改善了AD模型小鼠的认知能力下降和突触可塑性，并且AMPAR的运输和分布在介导长时程增强（LTP）中起着关键作用。因此，研究人员检测了A-miR-429对AMPAR亚基GluA1、GluA2、GluA3和GluA4表达的影响。结果显示，A-miR-429不影响4.5月龄AD模型小鼠脑组织总组织裂解物中总GluA1、GluA2、GluA3和GluA4的表达。然而，与WT相比，AD小鼠海马突触部分的GluA1和GluA2蛋白水平显著降低，而A-miR-429将突触GluA1（而不是GluA2）的蛋白表达恢复到WT水平。值得注意的是，海马突触部分GluA3和GluA4的蛋白水平在3组间无显著差异。

接下来，研究人员想进一步确定A-miR-429介导的表面GluA1增加的潜在机制。由于GluA1的S831和S845残基磷酸化在GluA1运输中起着至关重要的作用，因此研究人员探索了A-miR-429对GluA1磷酸化的影响。结果显示，与WT小鼠相比，4.5月龄AD模型小鼠的GluA1 S831磷酸化（pGluA1 S831）升高，导致pGluA1 S831和GluA1的比例显著增加，而A-miR-429处理可以降低pGluA1 S831的水平以及pGluA1 S831和GluA1的比例至WT水平。此外，无论A-miR-429处理与否，AD模型小鼠中GluA1 S845的磷酸化(pGluA1 S845)保持不变。进一步的实验也证实了鼻内给药A-miR-429(AD+A-miR-429)可降低pGluA1 S831水平。这些结果表明，pGluA1 S831在AD模型小鼠中增强，A-miR-429抑制miR-429-3p可降低pGluA1 S831水平。

据报道，在LTP期间，pGluA1 S831是GluA1插入突触后膜所必需的，但LTP在AD中受损。为了澄清这些相互矛盾的发现，研究人员收集了1.5-12月龄AD模型小鼠的脑组织，分析了GluA1和pGluA1 S831的表达。结果发现，AD中GluA1蛋白表达最初随着年龄的增长而增加，然后降低。而AD中pGluA1 S831蛋白表达最初降低，然后随着年龄的增长而增加。随着AD的进展，GluA1和pGluA1 S831的动态变化导致pGluA1 S831与总GluA1的比值逐渐升高。这些数据表明，在AD早期，适当的pGluA1 S831可能促进GluA1插入突触后，而在AD晚期，过量的pGluA1 S831可能导致含有GluA1的AMPARs重新分布并减少表面GluA1。

Fig3. A-miR-429增加APP23/PS45小鼠中GluA1的表面表达

4、抑制miR-429-3p可降低ERK1/2介导的GluA1 S831过度磷酸化

接下来，研究人员想要确定是什么原因导致miR-429-3p介导的MKP-1下调，从而降低AD中表面GluA1的蛋白表达。根据之前的研究报道，研究人员推测GluA1 S831的过度磷酸化可能与ERK1/2的过度激活有关。结果发现，AD模型小鼠的pERK1/2水平明显高于WT小鼠，A-miR-429可将pERK1/2水平挽救至正常水平，而总ERK1/2蛋白水平差异无统计学意义。与AD模型小鼠大脑中的发现相似，N2AAPP细胞中pGluA1 S831的水平高于N2A细胞。为了确定ERK1/2是否参与GluA1 S831的过度磷酸化，研究人员用ERK1/2抑制剂U0126处理N2AAPP细胞。结果显示，U0126处理显著降低了pGluA1 S831水平，增加了GluA1的表面表达。

鉴于MKP-1可以使ERK1/2失活，研究人员接下来探索了MKP-1对GluA1 S831磷酸化和表面表达水平的影响。结果表明，MKP-1的过表达降低了N2AAPP细胞中pERK1/2和pGluA1 S831的水平，并上调了AMPAR的表面GluA1亚基，但并未改变总ERK1/2的蛋白水平。与MKP-1过表达类似，A-miR-429处理显著降低了N2AAPP细胞中pERK1/2和pGluA1 S831的表达水平，并增加了GluA1的表面水平。无论A-miR-429处理与否，总ERK1/2的蛋白表达均保持不变。以上结果表明，A-miR-429可以通过MKP-1-ERK1/2信号通路抑制GluA1 S831的过度磷酸化，从而恢复含GluA1的AMPARs的表面水平。

Fig4. A-miR-429通过抑制MKP-1-ERK1/2介导的GluA1 S831的过度磷酸化来增加GluA1的表面表达

5、抑制miR-429-3p可减少Aβ诱导的原代培养神经元突触传递损伤

上述结果表明，A-miR-429对miR-429-3p的抑制能够促进AD模型小鼠的GluA1突触定位。接下来，研究人员想确定A-miR-429是否可以改善Aβ诱导的原代培养神经元中突触传递的损伤。结果显示，MKP-1的蛋白水平降低，而用A-miR-429阻断miR-429-3p挽救了Aβ处理24 h的原代培养神经元中MKP-1的水平。与体内实验结果一致，3组间总GluA1和GluA2蛋白水平无差异。然而，在接受Aβ处理的原代培养神经元中，GluA1（而不是GluA2）的膜表达显著降低。重要的是，A-miR-429处理抑制了Aβ诱导的GluA1膜表达降低。考虑到AMPAR在介导基底突触传递中的关键功能，研究人员接下来使用全细胞电压钳记录在原代培养的神经元中记录了mEPSCs。结果表明，Aβ处理显著降低了mEPSC振幅，但并未改变mEPSC频率。A-miR-429处理能够完全恢复Aβ诱导的mEPSCs振幅降低。

Fig5. A-miR-429通过增加原代神经元中GluA1的表面表达来改善突触传递

6、抑制miR-429-3p可减轻AD模型小鼠海马LTP和空间学习记忆的损伤

为了确定A-miR-429是否可以改善AD模型小鼠的突触可塑性和认知功能，研究人员每2天将1nmol A-miR-429或A-scramble通过鼻内给药治疗APP23/PS45双转基因AD模型小鼠。结果显示，与WT小鼠相比，AD模型小鼠海马CA1区LTP明显降低。重要的是，A-miR-429对miR-429-3p的抑制使AD模型小鼠受损的LTP恢复到WT水平。

为了直接检验A-miR-429是否可以缓解AD模型小鼠的认知障碍，研究人员采用Barnes迷宫和Morris水迷宫实验来测量空间学习和记忆。在Barnes迷宫测试中，AD模型小鼠的空间学习能力较WT小鼠明显受损，表现为在空间学习阶段找到逃生箱的时间较长。A-miR-429 治疗显著缩短了逃避盒的逃避潜伏期，尤其是在第4天和第5天。最后一次训练24h后，在逃避盒被封锁的情况下进行长时空间记忆恢复实验。结果显示，与WT小鼠相比，AD小鼠寻找逃避盒的准确性降低，而A-miR-429治疗将准确度恢复到WT水平。

为了进一步评估A-miR-429对AD模型小鼠记忆缺陷的改善作用，研究人员进行了另一项海马体依赖性学习和记忆任务，即Morris水迷宫实验。结果显示，在Morris水迷宫训练期间，AD模型小鼠的逃避潜伏期比WT小鼠长得多，A-miR-429治疗显著降低了AD模型小鼠的逃避潜伏期。最后一次训练试验24h后，在平台移除的情况下进行了探针测试以测试记忆保持能力。结果显示，与WT相比，AD模型小鼠进入平台区的数量明显减少，而A-miR-429处理增加了AD模型小鼠进入平台区的次数。以上结果表明，A-miR-429对miR-429-3p的抑制改善了AD模型小鼠的海马CA1 LTP损伤和记忆力下降。

Fig6. A-miR-429可减轻APP23/PS45小鼠海马LTP和空间学习记忆的损伤

研究结论

总之，本研究结果表明，miR-429-3p/MKP-1信号通路在AD的发病机制中起着关键作用。本研究发现年龄依赖性Aβ的产生可以通过miR-429-3p抑制MKP-1的表达，从而通过ERK1/2信号通路促进APP淀粉样蛋白沉积过程和Aβ聚集。反过来，增加的Aβ可能通过增加miR-429-3p来进一步抑制MKP-1，从而形成一个环。虽然这种环形成的具体机制还需要进一步探索，但本研究结果表明，在AD小鼠模型中，抑制miR-429-3p可以减少APP的淀粉样蛋白沉积过程，并通过上调MKP-1来改善突触和认知功能。因此，本研究为通过鼻内给药A-miR-429治疗与AD 患者和老年人相关的学习和记忆缺陷提供了潜在的治疗方法。