在寒冷暴露期间，激活的棕色脂肪组织（BAT）消耗大量的循环葡萄糖来为非寒颤产热提供燃料，并防御体温过低。然而，在这种体温调节挑战下，我们对BAT控制葡萄糖稳态的内分泌功能知之甚少。近日，Nature Communications期刊（IF16.6）在线发表了一篇题为Cold-activated brown fat-derived extracellular vesicle-miR-378a-3p stimulates hepatic gluconeogenesis in male mice的研究论文。该研究报道了在雄性小鼠中，寒冷激活的BAT源性细胞外囊泡（BDEVs）通过在寒冷应激期间促进肝脏糖异生来重编程全身葡萄糖代谢。寒冷暴露刺激miR-378a-3p（BAT富集的miRNAs之一）选择性封装到EV中并递送到肝脏中，通过靶向p110α促进糖异生。证明了寒冷诱导的BDEV含有的 miR-378a-3p 可以作为一种内分泌信号分子来调节寒冷应激下的肝脏糖异生。

 

 

研 究 结 果

 

1、寒冷激活的BAT促进肝脏糖异生

 

研究发现，低温暴露促进小鼠体温早期下降，但小鼠迅速适应，体温恢复到对照水平，说明生热作用被激活。此外，低温暴露后，小鼠肩胛间BAT (iBAT)密度增加，UCP1（BAT激活的标志）蛋白水平显著升高，BAT活性明显增加。同样地，产热相关基因的mRNA水平在寒冷诱导的BAT中显著升高。与先前的研究一致，低温暴露显著刺激了小鼠的每日食物摄入量，同时降低了体重，这表明代谢率的提高可以抵御低温。此外，寒冷暴露显著增加了BAT的葡萄糖摄取。有趣的是，低温暴露小鼠的肝脏糖异生也显著增加。

 

为了验证寒冷暴露对肝脏糖代谢的影响是否会直接受到BAT的影响，研究人员将小鼠肩胛间BAT (BATectomy)去除。结果发现，BATectomy小鼠早期体温下降更剧烈，适应相对较慢。此外，BATectomy没有改变食物摄入量，但导致血糖水平升高。同时，在寒冷暴露时，肝脏中糖异生基因表达水平降低，AKT、FOXO1和GSK3β磷酸化增加。这些数据强烈表明，BAT的激活可能通过促进寒冷应激下肝脏糖异生直接影响肝脏糖代谢。

 

Fig1. BAT在低温暴露时刺激肝脏糖异生

 

 

2、寒冷应激促进BAT源性细胞外囊泡分泌并递送到肝脏

 

接着，为了探索除经典的激素调节之外，BAT分泌的因子，如细胞外囊泡（EVs），是否也在这种BAT-肝脏串扰中发挥作用，研究人员从室温（RT）或寒冷暴露小鼠的iBAT中分离出BAT源性细胞外囊泡（BDEVs）。结果发现，Cold-BAT普遍比RT-BAT分泌更多的EV，并且寒冷激活BDEVs中EV标记物(包括CD9、CD63和ALIX)的蛋白水平显著升高。此外，在寒冷激活的BAT中PKM2磷酸化（p-PKM2）和总PKM2蛋白水平显著增加，表明PKM2也可能在促进活化BAT释放EV中起关键作用。随后，研究人员通过在体内外对BDEVs进行可视化和跟踪，证实了寒冷暴露促进了BDEV的分泌并递送到肝脏。

 

Fig2. 寒冷暴露诱导BAT源性EV分泌并递送到肝脏

 

 

3、寒冷激活的BDEVs增强糖异生

 

接下来，为了探讨寒冷激活的BAT分泌的EVs是否可以作为内分泌调节因子调节肝脏葡萄糖代谢，研究人员分别将Cold-BDEVs颗粒或Cold-BDEVs蛋白与肝细胞进行孵育。结果显示，两种处理都显著增加了葡萄糖的产生，同时增加了糖异生基因(Pgc-1α、G6Pase、Pepck)表达，降低了AKT的磷酸化水平。

 

考虑到寒冷激活的BDEVs在体外的显著效果，研究人员进行了体内研究以进一步验证。结果发现，静脉注射Cold-BDEVs的小鼠会导致糖异生基因表达水平升高， AKT、FOXO1和GSK3β磷酸化水平降低。值得注意的是，给药Cold-BDEV不会改变小鼠的食物摄入量、胰岛素或胰高血糖素水平。此外，Cold-BDEV处理小鼠的丙酮酸转化为葡萄糖的量增加。

 

为了验证Cold-BDEVs在调节糖异生方面的关键作用，研究人员还使用EV分泌抑制剂GW4869来阻断寒冷诱导的BDEV产生。结果显示，GW4869处理后，小鼠肝脏中磷酸化AKT增加，糖异生基因表达降低。这些结果证明了激活的BDEVs在寒冷暴露期间促进肝脏糖异生的关键作用。

 

Fig3. 活化的BAT源性EVs (Cold-BDEVs)增强肝脏糖异生

 

 

4、寒冷暴露诱导BDEVs中miR-378a-3p的富集

 

越来越多的证据表明，细胞来源的EVs含有许多miRNAs，这些装载在EVs中的miRNAs可以被受体细胞吸收以调节其功能。为了探索BDEVs是否也可以提供有助于寒冷诱导的肝脏糖异生的功能性miRNAs，研究人员进行了深度测序。结果发现，miR-378a-3p和miR-193b-3p是两个富集在肩胛间BAT（iBAT）中的miRNAs，在iBAT中的表达水平远高于包括肝脏在内的其他组织，并且它们的表达水平在冷暴露后显著升高。值得注意的是，与对照组小鼠相比，只有miR-378a-3p在寒冷暴露小鼠的BDEVs和血清EVs中显著上调，这表明miRNAs选择性地包装在激活的BDEVs中，并且miRNAs可能是在寒冷应激下选择性地包装在BDEVs中。因此，选择miR-378a-3p进行进一步研究，其在冷暴露小鼠肝脏中的表达水平明显升高。

 

Fig4. 鉴定BDEVs中有助于寒冷诱导的肝脏糖异生的功能性miRNAs

 

为了探索miR-378a-3p水平的升高是否源于肝脏转录水平的升高，研究人员检测了iBAT和肝脏中的原发miR-378a表达。结果显示，寒冷暴露后，miR-378a（原发miR-378a）的转录水平在iBAT中显著升高，而在肝脏中没有升高。此外，寒冷暴露显著提高了BAT中Ffar4 mRNA（据报道，Ffar4在BAT中正向调节miR-378a-3p）水平，但降低了其在肝脏中的表达，这与miR-378a-3p的转录水平一致。表明在对寒冷应激的反应中miR-378a-3p在BAT和肝脏中的转录可能受到差异调节。进一步的研究发现， RT-BDEV治疗小鼠和Cold-BDEV治疗小鼠的miR-378a-3p水平分别升高至~102 fmol/g和~182 fmol/g，而治疗前miR-378a-3p在肝脏组织中的表达为~79 fmol/g。此外，在BAT中局部注射GW4869导致寒冷暴露小鼠肝脏中的miR-378a-3p水平显著降低，而禁食小鼠则没有。另外，与对照组相比，BATectomy小鼠在寒冷暴露后血清EVs和肝脏中miR-378a-3p的表达水平明显降低，肝脏中原发miR-378a没有显著变化。这些结果强烈表明，肝脏miR-378a-3p的上调可能不是来自肝脏从头合成，而是在寒冷暴露后将BDEV富集的miR-378a-3p递送到肝脏。

 

Fig5. 寒冷暴露增加BDEVs中miR-378a-3p的表达

 

 

5、BDEV来源的miR-378a-3p促进糖异生

 

接下来，研究人员探索了miR-378a-3p在调节肝细胞葡萄糖代谢中的可能作用。首先，研究人员用荧光cy3标记的miR-378a-3p mimic转染原代培养的棕色脂肪细胞，收集BDEVs并与肝细胞孵育。结果发现，在肝细胞中出现红色荧光Cy3染料，表明Cy3-miR-378a-3p mimic可以通过BDEVs从棕色脂肪细胞直接递送到受体肝细胞。此外，过表达miR-378a-3p显著诱导培养的肝细胞产生葡萄糖，同时糖异生基因表达上调，肝细胞中p-AKT、p-FOXO1和p-GSK3β蛋白水平降低，并显著降低了肝细胞p110α蛋白水平。表明BDEV富集的miR-378a-3p可能是调节肝细胞糖异生的功能性信号分子。

 

为了探索Cold-BDEV源性miR-378a-3p对肝细胞的影响，研究人员用不同剂量的anti-miR-378a转染原代肝细胞，并与Cold-BDEVs共孵育。结果发现，当anti-miR-378a剂量逐渐增加时，p110α蛋白水平也呈剂量依赖性升高，并在100 nM处理时达到最大水平，此后保持不变。随着p110α蛋白水平的逐渐升高，糖异生基因的表达呈剂量依赖性下调，并在100 nM处理时降至最低水平。这些结果表明，miR-378a-3p作为Cold-BDEVs中的货物RNA，在促进肝糖异生中起重要作用。

 

Fig6. Cold-BDEV源性miR-378a-3p通过靶向p110α增强培养肝细胞中的糖异生

 

鉴于miR-378a-3p增加了原代培养的肝细胞的糖异生，因此研究人员评估了BDEV含有的miR-378a-3p在体内的作用。首先，研究人员通过构建表达miR-378a-3p的腺相关病毒（AAVFABP4-378a）在小鼠iBAT中实现了miR-378a-3p的过表达。结果发现，感染AAVFABP4-378a的小鼠血清EVs和肝脏中miR-378a-3p的表达水平也有所升高，表明iBAT中miR-378a-3p的过表达增加了miR-378a-3p分泌进入循环并递送至肝脏。值得注意的是，将miR-378a-3p引入iBAT并没有改变iBAT或肝脏中内源性miR-378a-3p的转录水平。此外，在miR-378a-3p过表达小鼠中观察到肝脏糖异生增加，表现为AAVFABP4-378a感染小鼠肝脏中糖异生基因的表达增强、p-AKT和p110α信号传导降低，而IR的磷酸化和总水平保持不变，证实了miR-378a-3p通过靶向肝脏中的p110α直接影响IR下游因子。综上所述，这些数据证实BDEV含有的miR-378a-3p可以通过直接靶向肝脏p110α促进体内糖异生。

 

Fig7. BAT中miR-378a-3p过表达可调节小鼠肝脏糖异生

 

 

6、恢复iBAT中的miR-378a-3p挽救了miR-378 KO小鼠的肝脏糖异生

 

为了研究miR-378a-3p在寒冷暴露期间调节葡萄糖稳态中的作用，研究人员生成了miR-378a KO小鼠模型（378KO）。结果发现，在RT饲养的378KO小鼠肝脏中检测到p110α蛋白水平升高。378KO小鼠的体重和食物摄入量没有明显变化，但血糖水平略有下降。此外，研究人员检查了寒冷暴露对378KO小鼠的影响。结果显示，与寒冷暴露WT对照相比，miR-378a的缺失表现出p110α的蛋白质水平显著增加。同样，在寒冷暴露的378KO小鼠的肝脏中，AKT磷酸化显著升高，Pgc-1α、G6Pase和Pepck表达降低，378KO小鼠的血糖水平降低，表明寒冷诱导的肝脏糖异生受损。此外，在iBAT中重新表达miR-378a-3p显著提高了378a KO小鼠肝脏中的G6Pase和Pepck，进一步证实了BAT来源的miR-378a-3p直接促进肝脏糖异生。

 

Fig8. 恢复iBAT中的miR-378a-3p挽救了miR-378KO小鼠的肝脏糖异生

 

 

7、BAT中miR-378a的缺失损害了寒冷诱导的肝脏糖异生

 

为了特异性敲低肝脏中的miR-378a-3p，研究人员构建了AAVTBG-sponge，通过静脉注射到小鼠体内并置于RT。在感染后25天小鼠寒冷暴露处理72h，结果发现肝脏中miR-378a-3p的敲低导致p110α和p-AKT蛋白水平显著升高，同时G6Pase和Pepck、Pgc-1α的表达降低。证实了肝脏中miR-378a-3p的缺失会损害寒冷诱导的糖异生。

 

为了直接证明iBAT中miR-378a-3p的特异性抑制是否会影响寒冷诱导的肝糖异生。研究人员构建了AAVFABP4-sponge并局部注入iBAT中。感染后25天，小鼠在处死前寒冷暴露3天。结果发现，AAVFABP4-sponge感染小鼠的BDEVs、血清-EVs和肝脏中的miR-378a-3p降低，而miR-378a-3p在肝脏中的转录不受影响，表明miR-378a-3p在BAT中的结合导致EV介导的miR-378-3p分泌到肝脏中减少。此外，iBAT中miR-378a的抑制不会改变寒冷暴露小鼠的体重，食物摄入量或胰岛素水平。iBAT中miR-378a的敲低显著提高了肝脏中p110α和p-AKT的蛋白水平，抑制了肝糖异生基因的表达，从而提供了直接证据，证明抑制BAT中miR-378a可以抑制寒冷诱导的肝糖异生。

 

Fig9. BAT中miR-378a-3p的缺失会损害寒冷诱导的肝脏糖异生

 

 

研 究 结 论

 

总之，本研究表明，在雄性小鼠中，激活的BAT来源的细胞外囊泡（BDEVs）通过在寒冷应激期间促进肝脏糖异生来重编程全身葡萄糖代谢。寒冷暴露有助于将miR-378a-3p（一种BAT富集的miRNAs）选择性包装到EVs中并递送到肝脏。BAT来源的miR-378a-3p通过靶向p110α增强糖异生。miR-378 KO小鼠在寒冷暴露期间表现出肝脏糖异生减少，而iBAT中miR-378a-3p的恢复诱导肝脏中糖异生基因的表达。这些发现为BDEV-miRNA作为应激诱导的细胞因子协调全身葡萄糖稳态提供了机制理解。这种miR-378a-3p介导的器官间通讯强调了BAT在预防寒冷应激期间低血糖方面的新型内分泌功能。

 

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-41160-6#Sec2

 

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