几十年来，众所周知的是，亚洲慢性淋巴细胞白血病（CLL）的发病率明显低于西方国家，但造成这种差异的原因仍然不清楚。近日，Haematologica期刊（IF10.1）在线发表了一篇题为Global miRNA profiling reveals key molecules that contribute to different chronic lymphocytic leukemia incidences in Asian and Western populations的研究论文。该研究报道了亚洲和西方B淋巴细胞中几个具有促CLL或抗CLL功能的重要microRNAs的差异表达可能导致两个种族群体之间CLL发病率的差异，并暗示miR-4485及其下游分子TGR5可能是潜在的治疗靶点。

 

 

研 究 结 果

 

1、亚洲和西方个体原代CLL细胞与正常B淋巴细胞中差异microRNA表达

 

本研究旨在揭示亚洲和西方个体原代CLL细胞与正常B淋巴细胞中microRNA表达的潜在差异。为了比较B淋巴细胞中的microRNA表达谱，并鉴定在这两个种族群体中差异表达的miRNAs，研究人员从健康亚洲人（n=9）、健康西方人（n=6）、亚洲CLL患者（n=22）和西方CLL患者（n=9）血液样本中分离B淋巴细胞，并纯化总RNA。随后对每个单独样品进行全局miRNA表达谱分析。结果发现，四组个体表现出明显可区分的miRNA表达谱，且四组个体之间的miRNA表达在分离趋势和聚类方面存在明显差异。

 

此外，6例亚洲CLL患者原代白血病细胞和9例亚洲健康供体正常B淋巴细胞中miRNA表达存在显著差异。同样，9例西方CLL患者原代白血病细胞中表达的常见miRs也与西方健康供体正常B淋巴细胞中表达的常见miRs显著不同。这些数据共同表明，亚洲样本CLL和正常淋巴细胞之间的差异表达miRs与西方样本有很大差异。其中一些差异表达的miRNAs，如miR-1295和miR-4485出现在两个种族中。这些miRNAs在两个种族群体中很常见，或者在特定群体中是独特的，因此，研究人员进一步分析了这些miRNAs以鉴定出可能导致两个种族群体之间不同CLL发病率的候选miRNAs。

 

Fig1. 亚洲和西方个体的原代CLL细胞和正常B淋巴细胞中的microRNA表达谱

 

 

2、鉴定可能导致亚洲人低CLL发病率的microRNAs

 

为了鉴定可能导致亚洲和西方群体不同CLL发病率的miRNAs，研究人员使用Venn图和热图来可视化每个种族群体正常淋巴细胞和CLL细胞中的差异miRNA表达谱，并使用来自西方健康供体正常B淋巴细胞中的miRNA表达作为对照，与其他3组进行比较。结果发现，仅有一个符合标准的microRNA（miR-4485）是可以促进CLL发育但在亚洲人中表达相对较低的潜在分子。在亚洲血统正常B淋巴细胞中低表达的84个microRNAs中，只有miR-4485在两个种族群体的CLL细胞中高表达。值得注意的是，尽管miR-1295在两个种族群体的CLL细胞中上调，但其在亚洲正常B淋巴细胞中的表达与西方样本相似，表明miR-1295是一种潜在的促癌分子，但不能解释亚洲人低CLL发病率的原因。

 

此外，Venn图还揭示了五个miRNAs（miR-181d、miR-181c、miR-363、miR-138和miR-181a）符合潜在CLL抑制因子的标准，它们在两个种族群体的CLL细胞中低表达，并且在亚洲健康个体正常B淋巴细胞中的表达高于西方健康个体正常B淋巴细胞。进一步分析显示，在两个种族群体所有CLL样本中，miR-4485上调，miR-181d、miR-181c、miR-363、miR-138、miR-181a下调。重要的是，在亚洲健康个体正常B淋巴细胞中，miR-4485显著下调，而miR-181d、miR-181c、miR-363、miR-138和miR-181a高度升高。特别值得注意的是，miR-4485在亚洲和西方CLL患者中的表达分别是同种族正常B淋巴细胞的9.5倍和2.3倍，而其在亚洲健康个体正常淋巴细胞中的表达比西方健康个体正常淋巴细胞低83倍。

 

Fig2. 鉴定亚洲和西方个体CLL细胞和正常B淋巴细胞中差异表达的miRNAs

 

 

3、高表达miR-4485促进CLL细胞增殖

 

接下来，研究人员通过定量RT-PCR检测发现，miR-4485在原代正常B淋巴细胞中表达较低，在CLL样本中显著升高。此外，检测结果还显示，亚洲正常B淋巴细胞中的miR-138、miR-181c、miR-363、miR-181a和miR-181d水平显著高于亚洲患者原代CLL细胞。

 

为了探索miR-4485对CLL细胞的功能影响，研究人员首先在两种CLL细胞系MEC1和MEC2中敲低或过表达miR-4485，并检测miR-4485抑制或过表达对细胞增殖的影响。结果显示，miR-4485敲低或过表达导致细胞增殖显著减少或增加。其次，研究人员还使用低水平内源性miR-4485的HEK293T细胞系，并用含有miR-4485过表达载体(pEZXMR03)的慢病毒或对照载体进行感染。结果显示，miR-4485在HEK293T细胞中的表达增加导致细胞增殖适度但显著增加。一致地，miR-4485 mimic也显著增加了HEK293T细胞的增殖，而miR-4485 inhibitor显著降低了细胞的生长。

 

Fig3. 定量分析关键miRNA表达及miR-4485对细胞增殖的影响

 

 

4、miR-4485抑制TGR5并激活ERK1/2途径

 

为了探索miR-4485促进细胞增殖可能有助于CLL发展的潜在机制，研究人员首先进行靶基因预测分析。结果发现，6个基因ASB7、CTDSPL2、FBXO32、JOSD1、MED1、TGR5可能受miR-4485调控。然后使用定量RT-PCR检测这6个基因在亚洲健康供体纯化的CD19+正常B淋巴细胞和亚洲患者分离的原代CLL细胞中的表达。结果显示，与正常淋巴细胞相比，只有TGR5基因在CLL细胞中的表达受到显著抑制，而其他5个基因在正常淋巴细胞和白血病细胞中的表达水平相似。GEO数据库表达分析也得到一致的结果。基于这些结果，研究人员重点探索了miR-4485对TGR5的潜在调控作用。荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-4485表达显著抑制了含有野生型miR-4485结合序列的细胞中的荧光素酶活性，而在转染了突变miR-4485结合序列的细胞中未观察到这种抑制。

 

Fig4. TGR5作为miR-4485靶分子的鉴定

 

为了进一步测试miR-4485下调TGR5表达的能力，研究人员用慢病毒介导的miR-4485过表达载体转染HEK293T细胞，并检测TGR5 mRNA和蛋白质表达。结果显示，过表达miR-4485导致TGR5 mRNA和蛋白质显著降低；相反，抑制miR-4485导致TGR5 mRNA和蛋白质显著增加。为了进一步测试miR-4485是否可以调节CLL细胞中的TGR5表达，研究人员将miR-4485 mimic、miR-4485 inhibitor转染MEC1和MEC2细胞。结果显示，miR-4485 mimic导致TGR5蛋白的减少，而miR-4485 inhibitor增加TGR5蛋白表达。

 

由于miR-4485及其靶基因TGR5在CLL发育中的作用在很大程度上仍然未知，研究人员随后探索了miR-4485对STAT3、Bcl-2、Bcl-xL、MEK1/2、ERK1/2和c-Jun等分子表达的潜在影响，这些分子对CLL细胞存活和增殖很重要。结果显示，miR-4485在HEK293T细胞中过表达导致TGR5蛋白表达降低和ERK1/2磷酸化增加，而总ERK1/2蛋白没有增加。磷酸化STAT3、总STAT3蛋白、Bcl-2和Bcl-xL的表达保持不变。相反，抑制miR-4485始终导致TGR5 mRNA和蛋白质上调，MEC-1和MEC-2细胞中磷酸化的ERK1/2和下游c-Jun和p-c-Jun蛋白的减少。

 

Fig5. miR-4485抑制TGR5表达，促进ERK1/2磷酸化

 

为了评估TGR5表达与ERK1/2激活之间的关系，研究人员首先测试了ERK1/2特异性抑制剂SCH772984对MEC1和MEC2细胞系以及原代CLL细胞中TGR5表达的影响。结果发现，ERK1/2的抑制导致TGR5表达增加，提示ERK1/2对TGR5的负调节。重要的是，TGR5在MEC1和MEC2细胞中的过表达或在原代CLL细胞中使用TGR5激动剂处理激活TGR5导致ERK1/2磷酸化降低，表明TGR5对ERK1/2激活的抑制作用。

 

为了进一步评估TGR5在介导miR-4485对ERK1/2和细胞增殖的调节中的潜在作用，研究人员首先产生了稳定的TGR5敲低细胞，这些细胞表现出ERK1/2磷酸化和细胞增殖的增加，然后用miR-4485 inhibitor转染细胞以测试其对ERK1/2和细胞增殖的影响。结果显示，在转染对照shRNA的MEC2细胞中，miR-4485的抑制始终导致TGR5表达的上调，ERK1/2磷酸化的抑制，以及细胞增殖的显著减少。相反，在shRNA敲低TGR5的MEC2细胞中，miR-4485 inhibitor不能再诱导TGR5表达，也不能抑制ERK1/2磷酸化。这些数据共同表明，TGR5可能在介导miR-4485对ERK1/2活化和细胞生长的影响中发挥重要作用。

 

Fig6. TGR5在介导miR-4485对ERK1/2激活的作用中起关键作用

 

 

研 究 结 论

 

总之，本研究通过对亚洲和西方个体原代CLL细胞和正常B淋巴细胞中全局miRNA表达谱的比较分析，鉴定出具有CLL促进功能的miR-4485和具有肿瘤抑制功能的miR-138、miR-181a、miR-181c、miR-181d和miR-363在亚洲和西方个体中存在差异表达，并可能导致两个种族群体CLL发病率的不同。miR-4485的促CLL活性可能是通过抑制TGR5表达介导的，从而降低其对ERK1/2磷酸化的肿瘤抑制作用，导致ERK1/2活化和白血病细胞增殖。

 

原文链接：

https://haematologica.org/article/view/haematol.2023.283181

 

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