肝癌是全球癌症相关死亡的第四大原因，而肝细胞癌（HCC）占原发性肝癌的大多数。尽管有全面的治疗方案，但晚期HCC患者的预后仍然很差。早期肝内转移，尤其是微转移，是HCC治疗和预后改善的巨大挑战。对HCC进展机制的深入了解可能是药物开发的关键。

 

细胞迁移是肿瘤转移的重要步骤，特别是从上皮细胞转移的肿瘤。在这个过程中，细胞骨架的重组和重塑是必不可少的。哺乳动物细胞骨架是最复杂和功能最多样的结构之一，参与了迁移、粘附、对外力的反应和细胞形状的适应等过程。之前的研究表明，细胞外基质（ECM）的粘附与HCC转移密切相关。同时，肿瘤细胞的粘附已被证明是细胞骨架形成和下游信号激活的开始。此外，细胞骨架状态[如肌动蛋白丝（F-actin）、paxillin等]可能影响细胞与ECM之间的相互作用。在细胞骨架蛋白中，原肌球蛋白4（TPM4）是参与非肌肉细胞细胞骨架的肌动蛋白结合蛋白的成员，可为F-actin提供稳定性并调节其他actin结合蛋白。尽管TPM4在几种恶性肿瘤中被报道为癌蛋白，但其上游机制尚不清楚。

 

前体信使RNA（pre-mRNA）剪接是真核生物基因表达的基本过程。在这个过程中，可变剪接是塑造表达模式的主要机制，剪接调节因子，如异质核核糖核蛋白（hnRNPs）和富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子，调节前者。此外，许多共同协同调节因子也参与了这一过程。Y盒结合蛋白1（YBX1）是一种众所周知的RNA结合蛋白（RBP），它可以与hnRNPs一起形成功能复合物，并调节pre-mRNA剪接和mRNA衰变。YBX1是一种高度无序的蛋白质，中间有固定的结构，适合与RNA相互作用。有趣的是，固有无序被认为是蛋白质液-液相分离（LLPS）的关键特征。

 

活性LLPS介导无膜区室的形成，从而在时空上调节许多关键的细胞过程，包括pre-mRNA剪接。LLPS通常由弱和动态的多价相互作用驱动，与固有无序区域（IDR）和支架核酸分子相关。同时，非编码RNAs（ncRNAs），如NEAT1和SNHG9，可以与RBPs协调并以浓度或结构依赖性方式诱导LLPS。最近的一项研究还表明，环状RNA（circRNA）VAMP3驱动CAPRIN1的LLPS并促进细胞质中应激颗粒的形成。ncRNAs如何影响LLPS引起了研究人员的广泛关注。但是需要鉴定更多功能性的RNAs，以便绘制出整个画面。

 

circRNAs是共价闭合的单链RNAs，被证明是一种广泛存在的功能性RNA物种。根据其定位和与其他分子的相互作用，circRNAs调节转录和剪接，调节mRNA的稳定性和翻译，影响蛋白质的功能和代谢，甚至在不同生物学和病理生理条件下直接作为翻译模板。在癌症研究中，越来越多的证据表明circRNA在肿瘤发生和发展过程中发挥了相当大的作用。然而，在circRNA应用于临床环境之前，还有很长的路要走。

 

近日，邵逸夫医院蔡秀军/史亮团队，一作刘柏强在PNAS期刊（IF11.1）在线发表了一篇题为Cytoskeleton remodeling mediated by circRNA-YBX1 phase separation suppresses the metastasis of liver cancer的研究论文。本研究将核circASH2鉴定为一个转移抑制性circRNA，其诱导YBX1的LLPS，从而介导细胞骨架重塑以抑制HCC的进展，为未来肝癌的治疗提供了理论依据。

 

 

为了鉴定参与HCC转移的功能性circRNAs，研究人员对10个原发性HCC组织进行了circRNA微阵列分析，其中包括5个高侵袭性（HI）HCC组织和5个低侵袭性（LI）HCC组织。结果显示，在两组之间共检测到236个差异表达的circRNAs，其中226/10个circRNAs在HI HCC中显著上调/下调。此外，研究人员还分析了已发表的HCC circRNA微阵列数据集GEO、GSE78520和GSE97332，并选择了每个数据集中表达差异最显著的前250个circRNAs进行后续的联合分析。结果鉴定了一个circRNA circASH2 (hsa_circ_0006302)在肿瘤细胞变得更具侵袭性的同时，其表达下降，这意味着circASH2可能具有肿瘤抑制作用。随后，研究人员通过Sanger测序、RT-PCR等实验对circASH2进行了表征及验证。进一步的研究发现，circASH2在非转移性细胞系中（HepG2、Huh7）的表达水平相对高于转移性细胞系（HCCLM3、HA22T、SK-Hep1）。表明circASH2作为circRNA可能在HCC转移中起重要作用。

 

Fig1. 鉴定参与HCC转移的功能性circRNAs

 

为了验证circASH2在HCC中的功能，研究人员分析了其在临床样本中的表达。结果发现，与匹配的非肿瘤组织相比，circASH2在大多数HCC肿瘤组织中几乎检测不到，并且HI组织中的circASH2水平明显低于LI组织。此外，肿瘤中较低的circASH2表达与总生存期和无病生存期（DFS）缩短密切相关。表明circASH2在HCC中具有肿瘤抑制作用。进一步的研究发现circASH2的下调至少部分是由HCC中DHX9的过表达引起的。

 

Fig2. circASH2在HCC中具有转移抑制作用并受DHX9调节

 

随后，研究人员使用三种典型的HCC转移小鼠模型进行动物实验，以验证circASH2对肝癌的影响。在原位异种移植小鼠模型中，对照组的大多数小鼠在肝脏中出现多灶性病变，在circASH2组中受到明显抑制。并且与circASH2组相比，对照组的小鼠出现了更多的肺/胃肠道（GI）转移。在快速尾静脉注射模型中，circASH2组中只有1/8小鼠（12.5%）出现肺转移结节，而对照组所有8只小鼠（100.0%）都有肺或骨转移。此外，circASH2组表现出明显更好的预后，包括总生存率和转移率。在脾内注射模型中发现了一致的结果，circASH2组明显禁止肝转移，而脾脏原位肿瘤在大小上没有差异。以上结果强烈表明circASH2可以抑制HCC转移，包括肝内转移、血源性转移和移植。

 

Fig3. circASH2在体内抑制HCC转移

 

接下来，根据内源性circASH2水平，研究人员通过慢病毒过表达、siRNA敲低或ASO沉默来操纵四种HCC细胞系中的circASH2表达。结果发现，circASH2过表达显著促进了胰蛋白酶消化后的细胞脱附，而circASH2沉默使细胞对胰蛋白酶消化更具抵抗力。此外，circASH2能强烈抑制肿瘤细胞中的F-actin和paxillin，这意味着细胞骨架受损。进一步的研究发现，circASH2可以通过下调肿瘤细胞的侵袭能力来削弱肿瘤细胞，此外circASH2降低了HCC细胞的迁移。另外，由特异性ASOs触发的circASH2沉默也会损害细胞骨架组装，并对HCC细胞迁移表现出促进作用。

 

Fig4. circASH2损害HCC中的细胞骨架组装

 

最后，机制研究发现，circASH2受DHX9负调控，并将TPM4转录本与YBX1/hnRNPs复合物连接起来，从而促进前者的NMD（无义介导的mRNA衰变）。此外，circASH2促进核YBX1的LLP，并通过与hnRNPs组装复合物来靶向TPM4转录本。这种circRNA/YBX1/hnRNP复合物干扰了TPM4转录本的剪接，并导致其加速降解。最后，与TPM4相关的细胞骨架/肿瘤粘附途径抑制了HCC的进展。

 

Fig5. 机制模型示意图

 

总之，本研究鉴定了一种核circRNA circASH2，其在HCC组织中优先丢失，并通过改变肿瘤细胞骨架结构来抑制HCC转移。TPM4是肌动蛋白的关键结合蛋白，被证明是circASH2的主要靶标，并被转录后抑制。这种调控是基于mRNA/pre-mRNA剪接和降解过程。此外，由circASH2增强的核YBX1的液-液相分离增强了TPM4转录本的衰变。总之，本研究结果揭示了一种肿瘤抑制性circRNA，更重要的是，揭示了HCC进展的精细调节机制。

 

原文链接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37459535/

 

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