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基于Cas9 mRNA的全RNA体系，让基因编辑更简单！

人阅读发布时间：2023-07-19 13:57

mRNA可瞬时表达所需的蛋白质，并且没有插入突变的风险，已经成为基因组编辑的强有力工具。相比于传统方法（质粒和病毒载体），通过mRNA进行基因编辑可避免许多诸如核酸酶的持续表达、或由于质粒和病毒的整合而无意激活先前沉默的基因组位点的风险。

CRISPR/Cas9作为目前最常使用的基因编辑系统，在crRNA和tracrRNA复合物（guide RNA）指导下，可将mRNA瞬时表达的Cas9蛋白靶向目标位点以进行DNA切割。锐博生物科学家团队基于丰富的合成经验，自主开发了采用天然复合物系统的全RNA CRISPR-Cas9基因编辑体系！

图1. 全RNA体系工作示意图

全RNA体系具有如下特点：

• 自主专利技术，优化的gRNA（crRNA与tracrRNA）和Cas9 mRNA

• 瞬时表达，有效降低脱靶率

• 编辑效率更高，适用于哺乳动物细胞

• 毒性更低，激活先天免疫反应更小，减少细胞死亡

• 即用型（Ready-to-Use），更加易用，适合从小规模实验到大规模高通量筛选

• 兼容多种导入模式：化学转染（mRNA转染）、电转或电穿孔、显微注射等

全RNA体系可提供基因编辑效率保证套装：

锐博生物可针对人源基因提供方便高效的基因编辑效率保证套装产品，利用设计软件挑选评分高的5条crRNA进行合成，基于Cas9 mRNA的体系而配置必备试剂，包括tracrRNA、Cas9 mRNA、mRNA转染试剂、阳性对照crRNA套装、T7E1酶及配套缓冲液等。可以实现MHCC97H细胞的T7E1酶切效率至少1条达到30%以上并提供相应的售后服务。

*效率保证套装：按说明书操作条件下，对MHCC97H细胞的T7E1酶切效率可实现至少1条达到30%以上，若5条均低于30%，客户须提供MHCC97H转染效率与检测方法步骤，经技术分析确认，免费重新优化设计，挑选合成5条crRNA并提供实验技术指导。

• crRNA设计合成：靶向目的DNA序列

riboEDIT Designed crRNA采用优化的生物信息学设计，包含20个与目标DNA序列互补配对的核苷酸（原间隔序列）和与tracrRNA互补配对的重复序列，涵盖人类和小鼠基因（其他物种需评估），每个基因设计合成3-6段单独的sgRNA，经过严格的PAGE纯化。

• 通用型tracrRNA：与crRNA形成gRNA

riboEDIT tracrRNA采用化学合成通用型tracrRNA，经PAGE纯化，能够抗核酸酶，能与crRNA结合形成crRNA/tracrRNA复合物，共同指导Cas9蛋白切割双链DNA。需要注意的是，riboEDIT tracrRNA与riboEDIT crRNA是专利配套体系，两者必须配套使用（不兼容其他体系的crRNA）。

• Cas9 mRNA：瞬时表达Cas9蛋白

riboEDIT Cas9 mRNA为体外转录生成，采用优化的加帽技术可实现高效且经济的共转录加帽以生成Ribo-Cap1结构，从而提高mRNA活性并降低免疫原性。此外，还针对IVT mRNA结构元件（5'UTR、3'UTR、编码区和poly A尾）进行了优化，使得优化后的mRNA结构系统地提高了其胞内稳定性和翻译效率。

Cas9 mRNA可在细胞内瞬时表达Cas9蛋白，在crRNA和tracrRNA复合物指导下对目的DNA序列进行剪切，相比质粒或病毒体系，有效地降低CRISPR基因编辑的脱靶效应，适用于哺乳动物细胞基因编辑。

图2. riboEDIT Cas9 Expression mRNA具有高效的基因组剪切效率

MHCC97H细胞共转染10pmol riboEDIT crRNA、10pmol riboEDIT tracrRNA和1ug riboEDIT Cas9 mRNA，48小时后 riboEDIT T7EI Enzyme酶切检测靶位点的剪切效率，候选7个靶基因的剪切条带及编辑效率。如图所示，#1#2表示同一基因不同位点设计的2条crRNA。

• T7E1 Enzyme酶：检测编辑效率

riboEDIT T7EI Enzymes是经E.coli重组表达的结构特异性酶，可识别并切割非完全配对的双链DNA、十字形结构DNA、 Holliday交叉DNA、异源双链DNA，或缓慢地切割带有切刻的双链DNA；可有效识别大于1个碱基的基因错配，广泛应用于由CRISPR-Cas9、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等工程核酸酶所介导的基因突变检测。