近日，ACS Nano期刊发表了一篇题为Biomodified Extracellular Vesicles Remodel the Intestinal Microenvironment to Overcome Radiation Enteritis的研究论文。其中，为了构建无miR-142表达的原代小鼠小肠细胞（PIC）来源的外泌体（PIC-exo|miR-142|KO），研究人员使用锐博生物CRISPR-Cas9全RNA体系来敲除PICs 中的Mir142基因。

 

Fig1. 使用CRISPR-Cas9全RNA体系构建PIC-exo|miR-142|KO的流程示意图

 

简单来说，即先将合成的crRNA（10 nM）、tracrRNA（10 nM）和Cas9 mRNA（1000 ng）与mRNA转染试剂混合。孵育5 min后，将混合物加入PICs中。将细胞进一步培养约48−72 h。用0.25%胰蛋白酶处理细胞，并使用含FBS的培养基将细胞稀释至终浓度（5个细胞/mL）。然后，将细胞以100μL/孔置于96孔板中。培养7−14天后，筛选单克隆细胞群以进行进一步培养。然后，从扩增的细胞中提取基因组和总RNA进行鉴定。对于基因组，以Positive Control crRNA作为阳性对照，采用RT-PCR方法检测Mir142基因中的剪切片段（773 bp）。对于总RNA，通过细胞中的qPCR分析验证miR-142水平。然后筛选Mir142敲除（KO）单克隆PICs，并分离外泌体进行进一步研究。用于验证的crRNAs靶序列和引物见下表。

 

 

结果显示，使用CRISPR/Cas9 mRNA系统将Mir142基因中的剪切片段（773 bp）敲除以后，与对照组相比，RT-PCR未检测到对应剪切片段的条带。此外，定量RT‒PCR检测发现，与对照组相比，在PIC |miR-142|KO中未检测到miR-142的表达水平。表明使用CRISPR-Cas9全RNA体系已成功实现PIC-exo|miR-142|KO的构建，可用于进一步实验。

 

Fig2. PIC-exo|miR-142|KO的验证

 

参考文献：

Li H, Zhao S, Jiang M, et al. Biomodified Extracellular Vesicles Remodel the Intestinal Microenvironment to Overcome Radiation Enteritis[J]. ACS nano, 2023.