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Cell Reports丨circSPECC1的m6A修饰可抑制RPE氧化损伤并维持视网膜内稳态

人阅读发布时间：2022-12-02 00:46

年龄相关性黄斑变性（AMD）是全球55岁以上人群不可逆视力丧失的主要原因，其可影响黄斑并逐渐扩展到视网膜后部的更大区域。晚期AMD可分为渗出性和萎缩性，具体取决于是否存在脉络膜新生血管。萎缩性AMD的典型特征是早期视网膜下色素上皮（RPE）沉积，称为玻璃膜疣（drusen），晚期RPE、脉络膜毛细血管层和光感受器缺失。目前尚未开发出针对萎缩性AMD的有效治疗方法，其确切机制也尚未完全阐明。RPE是AMD病理改变的主要部位。作为位于视网膜外光感受器和脉络膜血管之间的一种极化的、立方的和有色素的单层细胞，RPE构成了血液/视网膜屏障的一部分，在维持视网膜内稳态和光感受器活性方面发挥着至关重要的作用。鉴定触发RPE中病理事件的起始分子变化有助于开发萎缩性AMD的早期诊断和有效的治疗策略。

环状RNAs（circRNAs）是一组由宿主基因反向剪接而产生的内源性非编码RNAs，其两端共价连接成一个环。没有自由端的环状结构使circRNAs比其他RNAs更稳定，这是circRNAs作为多种疾病生物标志物和治疗靶点的理想特性。circRNAs的功能取决于它们在细胞内的定位。大多数细胞质circRNAs充当miRNA海绵，与miRNAs结合以释放其对miRNA靶标mRNAs的抑制。circRNAs参与视网膜的生物学和病理过程，但它们在AMD病因和RPE功能障碍中的作用尚不清楚。

N6-甲基腺苷（m6A）修饰被认为是编码和非编码RNA聚合酶II转录本中最丰富的内部修饰，对其动态调控有很大影响。据报道，m6A通过募集特定的m6A reader蛋白来控制circRNAs的转录后调节，包括核输出、反向剪接和翻译。m6A功能失调与增殖性玻璃体视网膜病变和血管生成性视网膜病变有关。然而，m6A修饰和m6A修饰的circRNAs在AMD发病机制中的作用从未被报道过。

近日，Cell Reports（IF9.995）期刊发表了一篇题为m6A modification of circSPECC1 suppresses RPE oxidative damage and maintains retinal homeostasis的研究论文。报道了一个来源于SPECC1（sperm antigen with calponin homology and coiled-coil domains 1）基因外显子4反向剪接产生的circSPECC1，其在AMD患者视网膜色素上皮（RPE）中表达下调，并阐明了circSPECC1通过m6A修饰和充当miR-145-5p海绵在RPE中抵抗氧化应激损伤并维持脂质代谢的分子机制。暗示circSPECC1的药物补充是AMD等萎缩性视网膜病变的一种有前途的治疗选择。

过氧化氢（H2O2）和NaIO3是可以损伤AMD中RPE细胞的氧化毒性物质。肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种多效性细胞因子，可诱导AMD的促炎性RPE改变。本研究通过转录组测序发现hsa_circ_0000745在H2O2处理的ARPE-19细胞中下调。Hsa_circ_0000745位于人类基因组chr17:20107645 ~ 20109225（mmu_circ_0003196对hsa_circ_0000745高度保守），由SPECC1基因转录，并由其外显子4的头尾剪接组成，将其称为circSPECC1。qPCR分析证实hsa_circ_0000745在经H2O2、NaIO3或TNF-α处理的原代人胎儿RPE（fRPE）和ARPE-19细胞中的表达持续下降。此外，FISH检测发现干性AMD患者黄斑RPE中hsa_circ_0000745荧光降低；在11例干性AMD患者血液样本中也发现hsa_circ_0000745水平降低。进一步的RNase R消化实验和Actinomycin D处理证实了circSPECC1的共价闭合结构。qPCR和FISH实验证明了RPE细胞中circSPECC1的细胞质表达。

Fig1. circSPECC1的特性和环状结构

为了研究circSPECC1是否参与调节RPE特性，研究人员通过将小干扰RNA（siRNA）转染到RPE细胞中来调节其表达。结果发现，circSPECC1的敲低导致fRPE和ARPE-19细胞中的线粒体ROS生成增加、线粒体质量降低。这些发现表明线粒体损伤是circSPECC1缺失引发的氧化应激的来源。进一步的实验表明RPE细胞中circSPECC1的缺失可导致氧化应激诱导的铁死亡、去极化和脂质代谢不规律。

Fig2. CircSPECC1敲低可诱导RPE细胞氧化损伤和脂质代谢异常

接下来，为了探索circSPECC1在体内是否介导RPE特性，研究人员合成了靶向小鼠circSEPCC1（mmu_circ_0003196）的动物用siRNA，并通过视网膜下注射到小鼠体内。结果显示，注射circSPECC1-siRNA-3可下调小鼠RPE中的circSPECC1表达。随后对小鼠的眼部表型进行检测发现，小鼠的视动反应（OMR）减少，反映为章动运动次数和时间减少，表明小鼠的视觉能力受损。并且在circSPECC1-siRNA注射组中发现萎缩性眼底伴片状色素异常。一致地，在缺乏circSPECC1的小鼠中还观察到点状高强度斑点和RPE萎缩。此外，OCT显示注射了circSPECC1-siRNA的小鼠视网膜厚度降低。这些结果表明小鼠RPE缺乏circSPECC1表现出视力下降和眼底萎缩。进一步的研究发现，circSPECC1的缺失还可诱导小鼠RPE的超微结构异常、肥大和上皮完整性降低。此外，circSPECC1缺失还可通过触发光感受器功能障碍和小胶质细胞激活来中断视网膜内稳态。

Fig3. CircSPECC1缺陷导致小鼠OMR降低、RPE异常和视网膜内稳态紊乱

随后，为了探索circSPECC1参与调节RPE特性的分子机制，研究人员进行了数据库分析、MeRIP-qPCR、RIP、荧光素酶报告基因实验、SELECT qPCR等实验。结果发现，circSPECC1转录本的核输出依赖于其N6-甲基腺苷（m6A）水平，circSPECC1转录本的m6A水平降低中断了其核输出，YTHDC1作为一个潜在的m6A reader。此外，CircSPECC1通过充当miR-145-5p的海绵来隔离其活性并阻断其与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（CDKN1A）的相互作用，从而保护RPE特性。

Fig4. circSPECC1参与调节RPE特性的模型示意图

之前的报道表明，miR-145-5p可诱导视网膜神经节细胞凋亡，但它在介导RPE功能中的作用此前从未被阐明。因此，研究人员接下来需要确定miR-145-5p过表达是否干扰细胞和小鼠的RPE功能。结果发现，与在缺乏circSPECC1的RPE细胞中观察到的表型一致，miR-145-5p过表达加速了fRPE和ARPE-19细胞中线粒体ROS的生成和线粒体生物发生的中断。进一步的实验发现，转染miR-145-5p mimic会导致fRPE和ARPE-19细胞中的GPX4表达降低、LPO增加、MDA水平升高、紧密连接和粘附连接减少和紊乱，以及RPE吞噬作用中断。此外，在过表达miR-145-5p的fRPE和ARPE-19细胞中发现了脂质积累的加速。

Fig5. miR-145-5p在体外加重RPE功能障碍

接下来，研究人员探索了miR-145-5p在介导体内RPE特性中的作用。与视网膜下注射circSPECC1-siRNA的小鼠眼部表型相似，在视网膜下注射miR-145-5p agomir的小鼠中发现章动运动的次数和时间减少，表明OMR降低和视觉能力受损。眼底照相进一步表明萎缩表型，FAF显示在miR-145-5p注射小鼠眼底有弥漫性自发荧光信号。OCT和H&E染色也证明了注射miR-145-5p agomir的小鼠视网膜厚度减小。TEM检测到局部过表达miR-145-5p的小鼠RPE细胞中脂褐素颗粒的增加和BrM的增厚。ORO染色显示注射miR-145-5p的小鼠RPE细胞中脂滴的积累。免疫荧光染色进一步显示，视网膜下注射miR-145-5p agomir的小鼠RPE细胞肥大，表现为细胞大小不规则和增大。此外，过表达miR-145-5p的小鼠表现出紧密和粘附连接下降、Rpe65荧光强度下调、光感受器缺失和小胶质细胞的活化。

Fig6. miR-145-5p在体内干扰RPE功能

以上结果表明miR-145-5p在RPE细胞中过表达模拟了circSPECC1在体外和体内的沉默效果。circSPECC1功能不全诱导的视网膜表型可通过抑制miR-145-5p得到缓解，并可通过过表达miR-145-5p而加重。

总的来说，本研究确定了circSPECC1在维持RPE功能方面的保护作用。circSPECC1的沉默诱导RPE氧化损伤和视网膜稳态中断。机制上，circSPECC1转录本中m6A水平的降低干扰了其核输出，YTHDC1作为潜在的reader。CircSPECC1通过直接充当miR-145-5p海绵调节RPE功能，以上调CDKN1A表达。CircSPECC1补充剂是AMD和其他涉及RPE功能障碍的视网膜病的一个有希望的治疗靶点。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124722015455#mmc1

本研究使用到的m6A试剂盒、circRNA siRNA、动物用siRNA、circRNA/U6/18S FISH探针及试剂盒、miRNA茎环法引物、mimic、inhibitor、动物用agomir产品均由锐博生物提供！更过关于circRNA或miRNA研究产品与服务信息，欢迎登陆锐博生物官网（www.ribobio.com）进行查询或来电咨询！