在整个COVID-19大流行期间，已经评估和引入了许多预防和治疗药物。在这些治疗中，结合并中和SARS-CoV-2病毒的单克隆抗体（mAb）已被应用于疫苗的补充和替代治疗。尽管已经使用不同的方法来生产mAb，但传统的杂交瘤融合技术由于其性能记录，仍然普遍用于此目的。近日，中国台湾中央研究院的研究人员在International Journal of Pharmaceutics期刊上发表了一篇题为An efficient approach for SARS-CoV-2 monoclonal antibody production via modified mRNA-LNP immunization的研究论文。该研究将杂交瘤融合策略与mRNA-脂质纳米颗粒（LNP）免疫相结合生成了针对SARS-CoV-2刺突（S）蛋白受体结合域（RBD）的mAbs，获得的mAbs可以与多种变体的SARS-CoV-2 RBDs结合，其中RBD-mAb-3对Alpha和Delta变体表现出特别高的结合亲和力和中和效力。表明mRNA-LNP免疫可能有助于快速生成针对新发传染病的高功能mAbs。

 

 

研究结果

 

1. 针对SARS-CoV-2的RBD mRNA-LNP免疫原的设计和表征

 

脂质纳米颗粒（LNPs）是mRNA体内递送最常用的工具之一。为了开发一种mRNA-LNP来递送SARS-CoV-2的RBD作为免疫原，基于已发表的病毒序列，研究人员利用T7体外转录（IVT）试剂盒从模板中生成SARS-CoV-2（氨基酸[aa] 319-541）的RBD。该合成的mRNA具有最佳的Cap-1结构和来自人IgG kappa链（IgGκ）的信号肽序列。为了提高mRNA稳定性和翻译，使用N1-甲基-假尿苷（m1Ψ）取代整个mRNA序列中的尿苷。LNP由四种脂质组成，包括D-Lin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和PEG-脂质，摩尔比为50:10:38.5:1.5。

 

Fig1. 修饰RBD mRNA-LNP的设计与合成

 

 

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生成RBD mRNA-LNP后，研究人员通过冷冻电镜观察发现该制剂由球形且均匀分布的LNPs组成，没有聚集。凝胶电泳阻滞实验显示，包裹在LNP颗粒中的mRNA没有出现游离的mRNA条带，表明mRNA完全包裹在LNPs中。添加Triton X-100破坏脂质膜后，mRNA从LNPs中释放出来，但没有表现出任何降解，不会改变mRNA的完整性。此外，RBD mRNA-LNP的粒径分布范围约为70~90nm，PDI小于0.15，表明粒径分布为单分散。进一步的实验显示RBD mRNA-LNP在4℃下储存长达4周后包封率（EE%）没有变化，表明RBD mRNA-LNP在制剂后是稳定的。

 

Fig2. 修饰RBD mRNA-LNP的物理化学特征

 

2. RBD mRNA或RBD mRNA-LNP表达的体外表征

 

为了评估转运的mRNA分子的细胞进入、货物逃逸和翻译，研究人员在用RBD mRNA-LNP转染HEK293T细胞后测量了RBD蛋白的表达。结果表明，HEK293T细胞可有效产生RBD并分泌到培养上清液中，并且mRNA-LNP转染以剂量依赖性方式诱导RBD蛋白表达。

 

Fig3. RBD mRNA-LNP表达的免疫原的体外表征

 

3. RBD mRNA-LNP免疫在小鼠中引发了强烈的抗原特异性免疫反应

 

接下来，研究人员想要比较用RBD mRNA-LNP免疫的小鼠和那些接受传统的基于蛋白质方法的小鼠之间抗体反应的强度和持续时间。免疫接种程序如下图所示：BALB/c小鼠每隔2周通过肌肉注射RBD mRNA-LNP进行免疫，或每隔3周通过腹腔内注射CFA-IFA佐剂中的重组RBD蛋白进行免疫。分别在初次注射前（第0周）和第二次加强注射后1周收集免疫前血清和免疫血清。随后，通过ELISA评估血清样品的RBD结合抗体滴度。结果发现，与蛋白质和佐剂免疫的小鼠相比，RBD mRNA-LNP免疫小鼠的血清对RBD蛋白的滴度显著更高。表明RBD mRNA-LNP免疫在小鼠中引发了强烈的抗原特异性免疫反应。

 

Fig4. RBD mRNA-LNP免疫在小鼠中引发了强烈的抗原特异性免疫反应

 

4. 单克隆抗体的产生和表征

 

RBD mRNA-LNP在小鼠中具有高度免疫原性，适用于随后产生针对RBD的mAbs。因此，可以使用RBD mRNA-LNP免疫小鼠进行细胞融合。最后一次注射后一周，从小鼠身上获得脾细胞并与NS1/1-Ab4-1 (NS-1)小鼠骨髓瘤细胞融合。在HAT组织培养基中培养和选择所得的融合杂交细胞。通过ELISA筛选杂交瘤克隆的上清液与重组RBD蛋白结合。结果发现，6个含有anti-RBD IgG1（κ轻链）的杂交瘤培养上清液表现出与RBD蛋白的特异性剂量依赖性结合。

 

Fig5. 杂交瘤mAbs的生成

 

同样地，研究人员也测试了杂交瘤培养上清与在5种VOCs（“引发忧虑”的变异病毒，包括Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron变体）中发现的突变相对应的RBD的结合能力。结果发现，mAbs可以与多种变体的SARS-CoV-2 RBDs结合。值得注意的是，RBD-mAb-1显示出与Omicron RBD变体的有效结合，而RBD-mAb-5对Omicron RBD变体的结合活性要弱得多。RBD-mAb-2、RBD-mAb-4和RBD-mAb-6与野生型RBD及大多数RBD变体结合良好，但它们与Omicron RBD的结合相对较弱。RBD-mAb-3与野生型RBD、Alpha RBD和Delta RBD强烈结合，但与Beta、Gamma和Omicron变体没有明显的结合。

 

Fig6. 杂交瘤培养上清液与不同SARS-CoV-2变体的RBDs的结合亲和力

 

此外，研究人员还检测了6个杂交瘤细胞培养上清液对5种SARS-CoV-2 VOCs假病毒的中和能力。结果表明，RBD-mab-3对Alpha和Delta RBD变体表现出高中和能力，IC₅₀值小于6.43 ng/ml。

 

Fig7. 杂交瘤培养上清液与不同SARS-CoV-2 VOCs假病毒的中和能力

 

5. RBD-mAb-3对SARS-CoV-2 Alpha和Delta的中和作用

 

由于RBD-mAb-3表现出对Alpha和Delta SARS-CoV-2变体假病毒的有效中和作用，因此选择它进行进一步的IgG抗体纯化和验证。为了检测纯化的RBD-mAb-3的结合活性，研究人员通过ELISA实验发现RBD-mAb-3对RBD Alpha和Delta变体具有高结合能力。进一步的研究发现，Y453A和Q474A突变（Y453、Q474是RBD中的残基，负责S蛋白与宿主受体ACE2的接触）显著降低了RBD-mAb-3的结合，提示这些残基有助于RBD-mAb-3的表位。随后，研究人员进一步检查了纯化的RBD-mAb-3对SARS-CoV-2 Alpha和Delta假病毒的中和能力。值得注意的是，RBD-mAb-3对Alpha和Delta变体表现出高中和能力，IC₅₀值分别为10.99和11.12 ng/ml。鉴于RBD-mAb-3对Delta RBD变体的特异性和结合亲和力，研究人员还使用真正的SARS-CoV-2 Delta变体在蚀斑减少中和试验（PRNT）中测试了它的中和潜力。结果发现，RBD-mAb-3有效中和病毒感染，PRNT₅₀值为12.71 ng/ml。总的来说，这些数据表明RBD-mAb-3是一种对SARS-CoV-2 Delta变体具有强大中和作用的mAb。

 

Fig8. RBD-mAb-3表现出对SARS-CoV-2 Delta的有效结合和中和作用

 

 

结论

 

大多数mAbs，包括许多获得许可的mAb药物，都是通过基于用蛋白质抗原免疫动物的杂交瘤技术开发的。尽管这种免疫方法已经普遍成功，但仍然存在一些局限性。编码目的蛋白的mRNA的成功递送为不需要纯化蛋白质的免疫原生产开辟了一条新的途径。本研究结果为设计一种新颖而强大的mRNA-LNP免疫方法提供了有价值的见解，该方法可以简化抗原制备过程，同时仍能诱导宿主动物产生良好的免疫反应，从而产生高质量的mAbs。

 

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517322008110?via%3Dihub

 

  

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