食道癌是一种全球致命的癌症，5年总生存率为18%。食管癌的发病率、死亡率和组织病理学在不同的地理区域存在差异，特别是在东非/南非和东亚地区的居民负担较高。腺癌和鳞状细胞癌是两种主要的组织学亚型，占食管癌的95%以上。在过去的几十年中，这种癌症的治疗方法取得了一些进展。目前，需要开发针对食管癌发生的新疗法。

非编码RNAs（ncRNAs）包括长链ncRNAs、microRNAs（miRNAs）、tRNA衍生的小RNAs、piwi相互作用RNAs和假基因在所有人类肿瘤的发生和进展中发挥着重要的调节作用。最近，环状RNAs（circRNAs）作为一种新兴的内源性ncRNAs亚群，可以作为癌症细胞周期、细胞凋亡、增殖、侵袭和迁移的关键调节因子。它们是通过pre-mRNA的反向剪接产生的，形成一个没有5'-帽或3'-poly(A)尾的共价闭合环，并且由于其广泛表达，相对较高的稳定性，以及在唾液、血液和外泌体中大量存在，因此，具有成为癌症诊断和预后生物标志物的潜力。CircRNAs可以作为miRNA海绵来调节肿瘤的发病机制，包括鳞状细胞癌。大多数研究集中在circRNAs在正常情况下的生物学作用。 circRNAs在低氧条件下的生物发生和功能仍不清楚。缺氧会破坏正常组织的稳态并重排肿瘤基质的相互作用。在缺氧的情况下，肿瘤细胞变得更容易迁移。已有研究报道缺氧可诱导肿瘤转移。临床上，肿瘤缺氧与对放疗或化疗的高耐药性和预后不良有关。因此，探索缺氧条件下食管癌中的circRNAs具有重要意义。

铁死亡是一种代谢应激诱导的细胞死亡，是由胱氨酸缺失和脂质活性氧（ROS）过度产生以铁依赖性方式引起的，并与缺血性损伤和癌症有关。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）通过还原谷胱甘肽（GSH）将脂质氢过氧化物还原为脂质醇，从而保护细胞免受膜脂质过氧化作用，并抑制铁死亡。铁死亡的形态学特征包括线粒体体积减少、线粒体嵴减少或缺失、线粒体外膜破裂、细胞核大小正常、无核浓缩，这与其他死亡模式有区别。由于癌细胞和正常细胞在铁和脂质代谢方面表现出生理差异以及异常的ROS产生，因此癌细胞可能比正常细胞更容易受到铁死亡的调节。已获批准的药物包括柳氮磺胺吡啶、索拉非尼和他汀类药物可以诱导铁死亡并抑制肿瘤生长。然而，铁死亡作为一把双刃剑，会在肿瘤微环境中引起免疫抑制，从而促进肿瘤生长。先前的一项研究表明，易迁移的癌细胞对铁死亡高度敏感。另一项研究表明，缺氧可以保护肿瘤细胞免于铁死亡。本研究揭示了食管癌细胞缺氧可激活铁死亡，并探讨了缺氧诱导的circRNA在铁死亡中的作用及其潜在机制。

通过反向剪接反应生成的circRNAs受到外显子跳跃事件和RNA结合蛋白（RBPs）的组合调控。RBPs包括ESRP1、ESRP2、PTBP1、TNPO1、RBM以及QKI，可以发挥剪接因子的功能来调节选择性剪接。Quaking（QKI）属于含KH结构域的STAR家族，可以影响pre-mRNA的剪接。将QKI的共有结合序列引入到侧翼内含子会导致在正常情况下仅通过常规线性剪接的外显子生成circRNAs。由于QKI可以形成二聚体，因此它被认为靶向侧翼内含子并使环化的外显子更靠近在一起，从而增加了circRNAs的生成。

近日，Molecular Cancer（IF41.444）期刊在线发表了题为CircBCAR3 accelerates esophageal cancer tumorigenesis and metastasis via sponging miR-27a-3p的研究论文。报道了一个在食管癌细胞中新鉴定的circRNA circBCAR3，其在食管癌组织和细胞中上调，并通过与miR-27a-3p结合上调TNPO1来加速食管癌的发生和转移。此外，E2F7诱导的剪接因子QKI促进circBCAR3的生物发生。提示circBCAR3可能是食管癌治疗的一个潜在靶点。
首先，研究人员从GEO数据库中分析了circRNAs在食管癌中的表达。基于GSE150476和GSE112496数据集，发现有5个circRNAs在食管癌中差异表达。为了探索缺氧条件下食管癌中这些失调circRNAs的表达是否会发生改变，研究人员在缺氧处理后检测了其在EC109细胞中的表达水平。结果发现缺氧处理后hsa_circ_0007624（circBCAR3）表达上调。PCR证实了circBCAR3在食管肿瘤标本和细胞系中表达明显升高。随后，研究人员对circBCAR3进行了表征，发现circBCAR3是由BCAR3 pre-mRNA（基因组位置chr1:94047857–94057950）的2、3、4、5外显子反向剪接形成的闭环结构。RNA-FISH显示circBCAR3主要存在于食管癌细胞的细胞质中。
为了探讨circBCAR3在食管癌发生发展中的作用，研究人员进行了功能缺失性实验。结果显示，沉默circBCAR3可抑制体外食管癌细胞的增殖、迁移、侵袭和铁死亡。此外，缺氧处理可显著促进食管癌细胞的增殖、迁移、侵袭和铁死亡，而CircBCAR3敲低明显逆转了缺氧诱导的这些影响。
为了探索circBCAR3在体内肿瘤生长和转移中的作用，研究人员构建了小鼠食管癌异种移植模型。结果显示，circBCAR3缺失可降低小鼠食管肿瘤的体积和重量。此外，研究人员还建立了肿瘤转移模型，通过尾静脉注射食管癌细胞来监测肺转移。结果发现，沉默circBCAR3可诱导小鼠肿瘤抑制，并且与对照组相比，沉默circBCAR3对食管癌肺转移有抑制作用。HE染色进一步证实了这一趋势。表明敲低circBCAR3减弱了体内食管肿瘤的生长和转移。
最后，研究人员通过生物信息学分析探索了circBCAR3的上游和下游机制，并通过RNA免疫沉淀和荧光素酶报告基因实验进行验证。结果发现，circBCAR3可以通过竞争性内源性RNA机制与miR-27a-3p相互作用，从而上调transportin-1（TNPO1）。此外，研究表明，剪接因子QKI是circBCAR3的正调节因子，通过靶向BCAR3 pre-mRNA中hsa_circ_0007624形成的外显子侧翼的内含子。RNA-seq分析发现缺氧诱导E2F7上调，E2F7在食管癌细胞中激活QKI的转录，QKI通过并置环状外显子来增加circBCAR3的形成。
总之，本研究通过促进癌细胞增殖、迁移、侵袭和铁死亡以及促进小鼠食管肿瘤发生和转移，创新性地证明了circBCAR3在食管癌中的致癌作用。在分子水平上，缺氧诱导的E2F7转录激活剪接因子QKI，其通过与形成circBCAR3的外显子侧翼的内含子QKI反应元件结合来促进circBCAR3的生物发生。CircBCAR3与miR-27a-3p相互作用上调TNPO1，从而在食管癌细胞中发挥其生物学功能。这些数据表明circBCAR3可作为食管癌研究和治疗的潜在标志物。

原文链接：
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-022-01615-8#Sec23

本研究中使用到的miR-27a-3p mimic/inhibitor及其NC、EdU细胞增殖检测试剂盒均由锐博生物提供！更多circRNA或miRNA研究产品与服务信息，欢迎登陆锐博生物官网（www.ribobio.com）进行查询或来电咨询！