胰腺β细胞功能障碍有助于2型糖尿病的发病机制。MiR-21已被证明在葡萄糖不耐受患者和2型糖尿病小鼠的胰岛中被诱导。然而，miR-21在胰腺β细胞功能调控中的作用在很大程度上仍然不明确。2022年6月21日，Nature Communications期刊（IF14.919）在线发表了题为MicroRNA-21 promotes pancreatic β cell function through modulating glucose uptake的研究论文。报道了胰岛β细胞中的miR-21通过miR-21-Pdcd4-AP-1依赖性途径上调Glut2表达，从而增强葡萄糖摄取，进而促进胰岛素分泌的分子机制。该研究结果进一步加深了我们对miR-21在调节胰腺β细胞功能和T2D发展中的作用的理解。
研究结果：

1、高糖和高脂联合上调胰岛miR-21的表达
之前的研究表明，胰岛β细胞中的miR-21可能在1型糖尿病（T1D）的发展过程中发挥重要作用。为了研究miR-21在T2D发展过程中的作用，研究人员首先检查了其在体外高糖、高脂或两者组合处理的小鼠胰岛中的表达。结果显示，高糖高脂联合处理（而非高糖高脂单独处理）的小鼠胰岛显著上调了miR-21的表达。接下来，研究人员在体内检测了miR-21在葡萄糖和/或毒性条件下的表达。结果发现，与对照小鼠相比，糖尿病db/db小鼠（而非ob/ob小鼠）胰岛中的miR-21表达显著增加。以上结果表明胰岛miR-21的表达在高糖高脂联合（而非单独高脂）条件下上调。
2、miR-21的遗传缺失导致葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损
为了探索miR-21在调节胰腺β细胞功能中的作用，研究人员从野生型（WT）和常规miR-21缺陷小鼠（miR-21KO）中分离出胰岛，并在葡萄糖存在的情况下进行体外培养。结果发现，虽然胰岛素分泌的基础水平（2.8 mM葡萄糖）相当，但当暴露于高浓度（16.7mM）葡萄糖时，缺乏miR-21的胰岛表现出胰岛素分泌的显著降低。随后，研究人员生成了胰腺β细胞特异性缺失miR-21的小鼠模型Ins2-Cre miR-21f/f（miR-21βKO），以进一步研究miR-21在胰岛β细胞中的作用。结果显示，3、7、10和27周龄的miR-21βKO小鼠在腹腔内葡萄糖耐量试验（IPGTT）中受到挑战时，葡萄糖耐量显著受损。此外，miR-21βKO小鼠的葡萄糖耐受不良伴随着葡萄糖负荷后血清中胰岛素浓度的降低。以上结果表明，miR-21在胰岛β细胞中是胰岛素分泌的正调节因子，其缺失会损害胰岛素分泌。
3、miR-21βKO胰岛中参与胰岛素分泌的细胞通路受损
为了研究miR-21如何增强胰岛素分泌，研究人员对WT和miR-21βKO小鼠的胰岛进行了mRNA测序分析。结果鉴定出597个基因表达上调，293个基因表达下调。GO分析显示差异表达的基因类型聚集成与胰岛素分泌相关的特定功能类别。miR-21βKO胰岛中上调的基因聚集成钾离子转运、葡萄糖输入的负调节、跨膜转运的负调节和分泌的负调节，下调的基因聚集成对葡萄糖响应、钙输入、钙依赖性胞吐作用、胰岛素分泌和细胞内转运。在获得的热图中给出了代表性mRNA水平的改变。这些数据表明，miR-21βKO胰岛中参与胰岛素分泌的细胞通路受损。
4、miR-21βKO小鼠的胰岛表现出葡萄糖摄取受损
为了进一步确定哪些特定通路受miR-21缺失的影响，研究人员检查了葡萄糖6-磷酸（G6P）的产生，这是葡萄糖代谢的一个关键中间体。结果显示，当暴露于高浓度葡萄糖时，miR-21βKO小鼠的胰岛产生的G6P显著减少。为了进一步证明miR-21在葡萄糖摄取或/和葡萄糖代谢中发挥重要作用，研究人员检测了胰岛暴露于葡萄糖时的氧消耗（OCR）。结果发现miR-21βKO小鼠的胰岛对葡萄糖添加的反应明显降低。使用葡萄糖摄取测定，进一步证明了miR-21βKO胰岛的葡萄糖代谢降低是由于葡萄糖摄取缺陷，这可以通过miR-21βKO胰岛中 NBD-葡萄糖的细胞内荧光强度降低来支持这一结果。
5、miR-21通过上调Glut2表达改善胰岛素分泌
Glut蛋白是一组广泛的跨膜蛋白，可促进葡萄糖跨质膜的转运。为了确定miR-21促进葡萄糖摄取的通路，研究人员检测了体外葡萄糖刺激下WT和miR-21βKO胰岛中5个重要Gluts的mRNA表达。结果表明，Glut2在胰岛中的表达水平最高，在miR-21βKO小鼠胰岛中的表达显著降低。其他Gluts的表达水平要么很低，要么无显著差异。此外，研究人员从WT和miR-21βKO胰岛中分离出胰岛β细胞，并证实了Glut2 mRNA表达在miR-21缺陷型β细胞中降低。进一步的实验证明了miR-21βKO小鼠胰岛中的Glut2蛋白表达显著降低。转录组学分析也证实了Glut2（Slc2a2）在miR-21βKO胰岛中的表达降低。

为了确定Glut2表达降低是否是miR-21βKO胰岛胰岛素分泌缺陷的原因，研究人员测试了Glut2的异位表达是否可以挽救在miR-21βKO小鼠胰岛中观察到的功能缺陷。结果显示，miR-21βKO胰岛中Glut2异位表达导致Glut2 mRNA水平完全恢复，并挽救了胰岛素分泌以响应16.7mM葡萄糖。这些结果表明，miR-21通过上调Glut2表达来促进胰岛素分泌。
6、miR-21通过miR-21-Pdcd4-AP-1通路促进Glut2表达
以前的研究表明，AP-1与Glut2的启动子结合并正向调节Glut2的表达。另一方面，程序性细胞死亡4（Pdcd4）是miR-21的一个经过充分研究的靶标，是AP-1活性的负调节因子。为了研究miR-21如何调节Glut2表达，研究人员检查了Pdcd4和AP-1的表达是否在miR-21βKO胰岛中发生改变。结果显示miR-21βKO小鼠胰岛中Pdcd4的mRNA和蛋白水平均升高，而AP-1亚基c-Jun的表达显著降低。

为了检测Pdcd4对Glut2表达的直接影响，研究人员使用Pdcd4特异性siRNA敲低β-TC-6细胞中Pdcd4的表达，发现在有效敲低Pdcd4表达的同时，Glut2蛋白水平显著升高。为了验证AP-1对胰腺β细胞Glut2表达的调控作用，研究人员首先构建了小鼠Glut2启动子报告基因，并与对照组或表达c- jun的质粒共转染β-TC-6细胞。结果显示，c-Jun过表达时，Glut2启动子活性显著增强。随后，研究人员检查了AP-1活性的改变是否会影响胰腺β细胞中的Glut2表达。结果表明，β-TC-6细胞中c-Jun的异位过表达增加了Glut2的mRNA和蛋白质水平，但用AP-1特异性抑制剂抑制胰岛中的AP-1活性则降低了它们的水平。这些数据表明miR-21在胰腺β细胞中可能通过miR-21-Pdcd4-AP-1-Glut2通路促进Glut2的表达。
7、递送miR-21至2型糖尿病小鼠的胰腺可降低血糖水平
由于已经确定miR-21作为胰岛β细胞中胰岛素分泌的正调节因子，接下来研究人员试图探索增加miR-21的水平是否可以改善胰岛素分泌，从而降低血糖水平。首先使用腺病毒在体外增加胰岛中的miR-21水平。结果显示，在小鼠胰岛中过表达miR-21后，miR-21水平和Glut2 mRNA表达显著增加。更重要的是，腺病毒介导的miR-21升高显著增加了葡萄糖诱导的胰岛素分泌。当使用人类胰岛时发现了类似的结果。此外，研究人员发现在小鼠insulin-1启动子控制下，腺病毒介导的小鼠胰岛中的miR-21过表达也增加了Glut2 mRNA表达和葡萄糖诱导的胰岛素分泌。
接下来，研究人员试图确定在体内提高胰岛中miR-21的水平是否可以降低血糖水平。首先通过静脉注射将Control或miR-21 agomir注射到6周龄2型糖尿病db/db小鼠体内，然后测量体重/血糖水平。结果发现，增加胰腺中miR-21水平可以显著降低血糖水平，而体重、体脂百分比和血脂水平没有受到影响。通过检测Glut2 mRNA水平仅在胰腺中增加证实了miR-21在胰腺中特异性发挥作用。此外，进一步的实验证实了胰腺中的Glut2蛋白水平也增加了。此外，研究发现给药miR-21 agomir后血清中的胰岛素浓度显著增加。这些数据表明，提高胰腺中miR-21水平能够促进Glut2表达和胰岛素分泌，从而显著降低血糖水平。
总之，本研究结果表明，胰岛β细胞中的miR-21可促进胰岛素分泌，并支持miR-21在调节2型糖尿病胰腺β细胞功能中的作用。

原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-022-31317-0

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