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RNAi实验沉默效果不佳，这个步骤不可忽视！
人阅读 发布时间：2020-03-24 14:06
完成一个RNAi实验，你可能需要先设计一条或多条高质量可以靶向目的基因的siRNA，然后将siRNA转染进细胞，最后siRNA与目的基因结合从而达到基因沉默的目的。看似很简单的一个实验过程，我们却经常会遇到各种问题，得不到预期的沉默效果，这其中涉及siRNA设计合成质量、细胞类型、细胞密度、转染方法、转染效率、siRNA浓度、基因表达水平等因素的影响。而RNAi实验沉默效果不佳的原因极有可能出现在这一步。
成功的转染是完成RNAi实验的前提，那么我们如何确定siRNA是否转染到细胞了呢，以及siRNA的转染效率如何？这就需要我们再完成一个实验步骤，设置一组荧光转染对照组来检测当前转染条件下细胞的转染效率，以判断是否成功转染siRNA。
锐博生物siRNA荧光转染对照是一种荧光标记无靶标siRNA，采用Cy3、Cy5、FAM 等荧光标记，荧光强度高，具有良好的抗淬灭性能。可以直接使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察，也可以通过流式细胞仪检测，以确定是否有效转染及转染效率的高低。帮助科学家进行siRNA转染条件优化，保证RNAi实验的顺利完成。
转染对照（Cy3）转染A549细胞6h后检测结果（200x荧光显微镜）
A: 转染对照siRNA; B: Hoechst; C: Overlay
转染对照（Cy3）转染Hela细胞12h后检测结果（激光共聚焦显微镜）
A: 转染对照siRNA; B: Hoechst; C: Overlay
产品特点
■ 采用Cy3、Cy5、FAM 等荧光标记，无其他化学修饰
■ 荧光强度高，具有良好的抗淬灭性能，尤其适合细胞实验中的转染效率检测
■ 兼容多种检测方法，可通过荧光显微镜、共聚焦显微镜、流式细胞仪检测
如何购买
登录锐博生物官网www.ribobio.com，在线搜索siR Transfect Control即可直接加入购物车进行选购，2020年即日起-3月31日在线下单还可享受75折优惠价，赶紧订购吧！
■ 采用Cy3、Cy5、FAM 等荧光标记，无其他化学修饰
■ 荧光强度高，具有良好的抗淬灭性能，尤其适合细胞实验中的转染效率检测
■ 兼容多种检测方法，可通过荧光显微镜、共聚焦显微镜、流式细胞仪检测
如何购买
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运输保存
产品以冻干粉的形式储存于棕色管中，常温运输。收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。使用前瞬时离心，用RNase-free Water配制成20μM储存液，分装避光保存，避免反复冻融（不超过5次）。
表1. 20μM储存液的配制参考
注：所有过程请注意避光！
使用前须知
1. 我们提供三种荧光基团标记的siRNA，进行实验前请先了解检测仪器的配置和参数，选择合适的荧光标记。
2. 请先熟悉转染操作，以快速准确的完成荧光标记siRNA的转染。
可使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测，使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜可获得图像以分辨假阳性，使用流式细胞仪检测可快速得到转染率，减少多次拍照和计数的操作。
检测时间点：按转染试剂要求弃掉转染液更换为新鲜培养基的时间点上检测，或者其它合适的时间点。
注：由于Cy3和Cy5为脂溶性，可能粘附于细胞表面影响观察，推荐使用激光共聚焦显微镜进行检测。
以下是MHCC97H细胞分别转染FAM、Cy3、Cy5标记的siRNA激光共聚焦显微镜拍照的结果。
图1. 分别使用FAM、Cy3、Cy5标记的siRNA转染MHCC97H细胞后进行激光共聚焦显微镜拍照
使用前须知
1. 我们提供三种荧光基团标记的siRNA，进行实验前请先了解检测仪器的配置和参数，选择合适的荧光标记。
表2. 锐博生物荧光标记siRNA可选荧光
2. 请先熟悉转染操作，以快速准确的完成荧光标记siRNA的转染。
3. 储存、使用及检测过程中请注意避光。
4. 检测前请先熟悉检测仪器的操作，若使用荧光显微镜或激光共聚焦检测，检测时不宜同一位置曝光时间过长，应对好焦后马上拍照，防止曝光时间过长而荧光淬灭。
使用方法
具体操作请参考使用的转染试剂说明，最好设置合适的转染试剂浓度及荧光标记siRNA浓度梯度，综合考虑转染率及转染试剂副作用，以选择合适的浓度进行RNAi实验。
下面以riboFECT CP Reagent转染 siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器的试剂用量请参考表3，若使用其它转染试剂，请参考对应转染试剂说明书。
a. 稀释siRNA：用30μl 1X riboFECT CP Buffer（v2）稀释1.25μl 20μM siRNA储存液（v3），轻轻混匀。
b. 混合液制备：加入3μl riboFECT CP Reagent（v4），轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min，制备成转染复合物。
注：①请勿振荡，溶液可能会有浑浊，但不会影响转染；②混合液可室温放置一段时间，但不宜超过24h。
c. 将riboFECT CP混合液加入到465.75μl无双抗完全培养基（v1）中，轻轻混匀。
注：riboFECT CP转染复合物加入至原细胞培养基中一般无需移除或更换，但亦可依据具体实验情况进行优化。
d. 将细胞置于培养箱中正常培养
使用方法
1. 转染
具体操作请参考使用的转染试剂说明，最好设置合适的转染试剂浓度及荧光标记siRNA浓度梯度，综合考虑转染率及转染试剂副作用，以选择合适的浓度进行RNAi实验。
下面以riboFECT CP Reagent转染 siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器的试剂用量请参考表3，若使用其它转染试剂，请参考对应转染试剂说明书。
a. 稀释siRNA：用30μl 1X riboFECT CP Buffer（v2）稀释1.25μl 20μM siRNA储存液（v3），轻轻混匀。
b. 混合液制备：加入3μl riboFECT CP Reagent（v4），轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min，制备成转染复合物。
注：①请勿振荡，溶液可能会有浑浊，但不会影响转染；②混合液可室温放置一段时间，但不宜超过24h。
c. 将riboFECT CP混合液加入到465.75μl无双抗完全培养基（v1）中，轻轻混匀。
注：riboFECT CP转染复合物加入至原细胞培养基中一般无需移除或更换，但亦可依据具体实验情况进行优化。
d. 将细胞置于培养箱中正常培养
表3. 使用riboFECT CP转染siRNA用量参考
v1：细胞培养基；v2：1XriboFECT CP Buffer；v3：20μM siRNA；v4：riboFECT CP Reagent
2. 检测
可使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测，使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜可获得图像以分辨假阳性，使用流式细胞仪检测可快速得到转染率，减少多次拍照和计数的操作。
检测时间点：按转染试剂要求弃掉转染液更换为新鲜培养基的时间点上检测，或者其它合适的时间点。
注：由于Cy3和Cy5为脂溶性，可能粘附于细胞表面影响观察，推荐使用激光共聚焦显微镜进行检测。
以下是MHCC97H细胞分别转染FAM、Cy3、Cy5标记的siRNA激光共聚焦显微镜拍照的结果。
图1. 分别使用FAM、Cy3、Cy5标记的siRNA转染MHCC97H细胞后进行激光共聚焦显微镜拍照
3. FAQ
1. 转染率如何检测？
转染率可通过转染带荧光标记的RNA oligo进行检测，一般可以转染后在荧光显微镜下检测计算阳性比例，或者通过流式细胞仪检测阳性率。某些细胞对荧光染料的粘附比较严重，且Cy3、Cy5为脂溶性染料，可能会造成假阳性结果，所以通过激光共聚焦显微镜成像的方式检测会更好一些，并依靠经验判断真假阳性信号。另外，我们推荐使用转染指示剂riboMONITOR进行转染率检测，由于成功转染进细胞中的RNA oligo会富集定位于核内，可与粘附于细胞膜上的假信号显著区分，可以更准确的判断转染率。
2. 我想在目的siRNA标记荧光，同时检测转染效率和作用效果，这样做可以吗？
为尽量避免对目的siRNA作用效率的影响，通常选择用转染对照来检测转染效率，用无荧光标记的目的siRNA来检测作用效果。当然也可以尝试对目的基因siRNA标记荧光，同时检测转染效率和作用效果，但可能会有标记后siRNA失效的风险。
3. 转染对照转进去了就能代表目的siRNA转进去了吗？是不是每次实验都必须做？
转染效率的高低主要与细胞自身及所选择的转染试剂和转染方法相关，同等实验条件下，siRNA的转染效率应该是相近的，如果荧光对照能成功进入细胞，可以间接代表目的siRNA也成功进入细胞。在具体的实验中，荧光对照不一定要求每次实验都做。但如果每次实验都做一个荧光对照组，将会更加便于排除一些实验问题。
4. 我该选择什么标记的荧光标记？标记在siRNA双链的哪条链、哪端？
1）一般细胞水平检测转染效率偏向推荐FAM/Cy3标记，动物活体成像偏向推荐Cy5/Cy7标记；
2）如果实验目的为检测转染效率，建议标记在非作用链5’端。
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