推荐产品
公司新闻/正文
中科院发现RNA甲基化对细胞重编程重要作用
人阅读 发布时间:2015-03-03 17:11
真核生物的RNA分子上可发生100多种修饰,其中腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰(N6-methyladenosine, m6A)是高等生物mRNA上含量最为丰富的修饰。m6A修饰参与调控mRNA的剪接、运输、稳定性和翻译效率等。并且与肥胖和肿瘤等多种生理功能异常及疾病相关。但受到研究方法的限制,关于m6A修饰的研究长期进展缓慢。
本项研究中,研究者首先选择小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stemcell,ESC)、诱导型多能干细胞(induced pluripotentstem cells,iPSCs)、神经干细胞(neural stem cell,NSCs)和睾丸支持细胞(testicular sertolicell,SCs)四种不同细胞进行了meRIP-Seq,绘制出了不同细胞之间的m6A差异图谱,共鉴定出887个基因转录本有细胞特异性m6A修饰,分析表明这些转录本会参与到许多细胞特异性生物学过程中,如ESC和iPSC的细胞干性保持及细胞分化发育调控,它们所对应的基因也包含许多与功能相关的转录因子基因,如Oct4、Nanog等。当研究者在小鼠成纤维细胞(MEFs)表达4个山中因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)中过表达m6A甲基转移酶METTL3时,随着细胞内m6A水平上升,MEFs重编程效率和iPSC克隆数目明显上升,若敲除METTL3,效果正好相反,这也表明m6A确实会提高重编程效率,是MEFs重编程过程所必需的。
四类细胞中特异性基因表达情况及m6A分布情况
MEF中敲除METTL3后几个多能性相关基因的转录状态变化
过表达几个突变型miRNA会上调其靶基因的转录本m6A水平,但转录本水平没有明显下降
过表达及沉默野生型miR-330-5p和突变型miR-1981-5p时METTL3与靶点结合状况
为了对m6A在重编程过程中的角色进行解释,研究者首先对meRIP-Seq中鉴定出m6A peak的motif分析,发现将近90%的m6A区域包含于RRACH motif内,软件预测发现,该motif与482个miRNA的种子序列区互补,在ESC中进行small RNA-Seq也进一步证实了预测结果,表明miRNA确实靶向某些特殊转录本上存在于RRACH motif内的m6A peak区域。通过m6A印迹实验发现,如果用siRNA沉默miRNA加工关键酶Dicer,小鼠NSC和HeLa细胞内,m6A丰度会随之降低,但敲除AGO蛋白则不会影响m6A丰度,若过表达与m6A peak配对的miRNA,m6A水平又会上升,沉默miRNA,m6A水平也会下降。且不管敲除Dicer和AGO或者过表达miRNA,m6A甲基转移酶METTL3和脱甲基酶FTO、ALKBH5都没有变化。如果突变miRNA中种子区域,使其能与转录本上非m6A peak区域结合,在这种突变型miRNA在鼠NSCs中过表达时,能在不影响原本m6A peak的情况下增加非m6A peak区域m6A水平。在这些实验结果下,研究者推测miRNA可能会调控METTL3与mRNA互作,以产生对m6A的调控功能。通过免疫荧光实验发 现,在Dicer被敲除的HeLa细胞中METTL3在核附近密度明显下降,但核内及胞质内METTL3整体水平并没有变化。co-IP分析也表明 Dicer并非与METTL3直接互作。后续的PAR-CLIP实验表明,HeLa细胞内Dicer被敲除所造成的miRNA缺陷会造成RNA与 METTL3互作减弱,在鼠NSC中,效果依然,但两类细胞中METTL3和mRNA整体丰度并没有变化。
本文所确认的通路图
通过一系列实验,研究者确认了m6A在促进体细胞重编程为多能性干细胞中的重要作用,揭示了miRNA通过序列互补调控m6A修饰的全新作用机制。在解析m6A修饰形成的位点选择机制、拓展miRNA的新功能和发现新的细胞重编程调控因素方面均取得了开创性的重要突破。
相关文献:Chen T, Hao Y J,Zhang Y, et al. m6A RNA Methylation Is Regulated by MicroRNAs andPromotes Reprogramming to Pluripotency[J]. Cell stem cell, 2015.