众所周知，系膜细胞中细胞外基质（ECM）的合成是糖尿病肾病（DKD）的主要决定因素。阐明ECM合成中的主要参与者可能有助于为防止DKD进展提供有希望的候选药物。tRF3-IleAAT是由tRNA特异性位点的核酸酶产生的tRNA衍生的片段（tRF），在糖尿病和DKD患者的血清中差异表达。近日，Acta Pharmacologica Sinica期刊发表了一篇题为tRF3-IleAAT reduced extracellular matrix synthesis in diabetic kidney disease mice by targeting ZNF281 and inhibiting ferroptosis的研究论文。该研究报道了tRFs在DKD中的潜在作用，揭示了tRF3-IleAAT通过靶向ZNF281抑制铁死亡，从而减缓DKD模型中ECM合成的作用机制，表明tRF3-IleAAT可能是一个有吸引力的DKD治疗靶点。

 

 

之前的测序结果显示，tRF3-IleAAT在DKD患者血清中的表达显著降低，进一步的功能分析表明，细胞死亡和能量代谢与tRF3-IleAAT有关。在本研究中，研究人员将12周的Db/Db小鼠改编为DKD模型，并首先验证了db/db小鼠中tRF3-IleAAT的下调。此外，db/db小鼠在20周龄时的尿蛋白和sCr水平显著更高，肾脏组织病理形态异常，肾小球系膜间质增多且明显扩张，间质胶原沉积增多，纤维化增多。进一步的研究发现，在db/db小鼠肾小球中，ECM成分FN的荧光明显增强，且与ECM合成相关的FN和Col I的表达在db/db组中显著更高。另外，在高糖（HG）处理的小鼠肾小球系膜细胞中也观察到tRF3-IleAAT的表达降低，且FN和Col I在HG处理组中的表达明显高于对照组。

 

Fig1. tRF3-IleAAT在DKD模型中下调

 

接着，研究人员评估了tRF3-IleAAT在db/db小鼠ECM合成中的作用。结果显示，在db/db小鼠中过表达tRF3-IleAAT导致sCr和24h尿蛋白水平有所降低，胶原沉积面积减少，结合PAS染色，这一发现表明肾小球扩张和纤维化减少。此外，过表达tRF3-IleAAT导致FN荧光强度减弱，FN和Col I的mRNA和蛋白水平明显低于对照组。为了阐明tRF3-IleAAT对ECM合成的影响，研究人员使用tRF mimic在体外过表达tRF3-IleAAT。结果显示，HG+tRF3-IleAAT mimic组FN和Col I的mRNA和蛋白表达水平显著低于对照组。表明tRF3-IleAAT过表达可减轻DKD模型中ECM的合成。

 

Fig2. tRF3-IleAAT过表达可减轻DKD模型中ECM的合成

 

在之前的研究中，KEGG分析显示tRF3-IleAAT功能在铁死亡相关信号通路中高度富集。为了探讨铁死亡在DKD中的作用，研究人员检测小鼠中铁死亡相关指示因子的表达水平。结果显示，db/db组小鼠肾组织中ACSL4的表达显著升高，GPX4和SLC7A11的表达显著降低，证实了铁死亡的发生。而使用铁死亡抑制剂Fer-1处理则导致ACSL4的表达显著更低，GPX4和SLC7A11的表达显著更高。此外，Fer-1处理导致小鼠24h尿蛋白和sCr水平显著降低，胶原沉积减少，肾小球扩张水平降低，纤维化减少，FN的荧光强度减弱，且肾脏FN和Col I的表达水平明显低于对照组。细胞实验也得到类似的结果，证实了铁死亡是ECM合成的关键因素。以上结果表明，抑制铁死亡可减轻体内和体外ECM的合成。

 

Fig3. 抑制铁死亡可减轻体内和体外ECM的合成

 

鉴于tRF3-IleAAT过表达和铁死亡的抑制均可减少DKD中ECM的合成，研究人员假设tRF3-IleAAT可能抑制铁死亡以减少ECM合成。接下来，研究人员评估了tRF3-IleAAT在db/db小鼠铁死亡发病中的作用。结果发现，tRF3-IleAAT过表达导致GPX4和SLC7A11表达显著更高，ACSL4表达显著更低，并导致GSH水平显著升高。体外实验显示，tRF3-IleAAT过表达导致铁死亡相关指示因子的表达发生显著改变，ROS水平有一定程度的降低。此外，用tRF3-IleAAT mimic处理后，系膜细胞的线粒体嵴变得清晰可见，并且缓解了萎缩和膜密度增加等形态变化。GSH检测结果显示，tRF3-IleAAT过表达导致GSH水平显著高于对照组，而Fe2+和MDA水平趋于较低，进一步证实了tRF3-IleAAT对DKD模型铁死亡的抑制作用。

 

Fig4. tRF3-IleAAT过表达缓解DKD模型中的铁死亡

 

接下来，研究人员探讨了tRF3-IleAAT减少DKD小鼠和HG处理系膜细胞ECM合成并抑制铁死亡的可能机制。首先，研究人员预测了tRF3-IleAAT的下游靶基因，揭示了26个靶基因，其中ZNF281的靶基因评分最高，极有可能参与组织细胞纤维化和炎症。进一步的研究发现，ZNF281在db/db小鼠中表达显著升高。免疫组化分析显示，ZNF281在db/db小鼠肾组织中高表达。接着，研究人员假设tRF3-IleAAT可能靶向ZNF281并减弱铁死亡。为了验证这一点，研究人员使用ZNF281 siRNA敲低ZNF281的表达。结果表明，敲低ZNF281 导致ACSL4、FN和Col I的表达显著降低，GPX4和SLC7A11的表达显著升高。此外，敲低ZNF281导致GSH水平较高，进一步阐明了ZNF281与铁死亡之间的相关性。

 

Fig5. 敲低tRF3-IleAAT下游靶基因ZNF281可缓解HG诱导的系膜细胞中的铁死亡

 

最后，为了进一步阐明tRF3-IleAAT与靶基因ZNF281之间的相互作用，研究人员检测了DKD模型中过表达tRF3-IleAAT后ZNF281表达的变化，以评估tRF3-IleAAT对基因表达水平的影响。结果显示，过表达tRF3-IleAAT导致ZNF281表达显著更低。结合位点预测分析显示，tRF3-IleAAT与ZNF281的3'UTR碱基完全互补，序列保守。双荧光素酶报告基因实验进一步证实了tRF3-IleAAT与ZNF281基因3'UTR的靶向结合。此外，tRF3-IleAAT mimic和ZNF281质粒共转染在很大程度上抵消了tRF3-IleAAT对铁死亡和ECM合成的抑制作用，GPX4、SLC7A11、ACSL4、FN和Col I水平的显著改变证明了这一点。以上结果表明，tRF3-IleAAT可能通过直接靶向DKD中的ZNF281抑制铁死亡和ECM合成。

 

Fig6. tRF3-IleAAT直接靶向ZNF281并负调控其表达

 

总之，本研究阐明了tRF3-IleAAT在DKD动物模型和HG处理的系膜细胞中的作用和机制。提出了tRF3-IleAAT通过降低ZNF281的表达来抑制铁死亡，从而减少系膜细胞中的ECM合成并延缓DKD的进展。然而，锌指蛋白在铁死亡中的作用机制值得进一步深入研究。此外，研究人员希望能够在后续研究中确定ZNF281在动物模型中调节DKD发展的方式。本研究从tRFs和铁死亡的角度对DKD的分子机制提供了新的见解，为DKD的临床诊断和治疗提供了理论依据。

 

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41401-024-01228-5

 

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