肠缺血/再灌注（I/R）损伤是一种严重的临床疾病，没有最佳的诊断标志物，也没有明确的分子病因学见解。血浆外泌体环状RNAs（circRNAs）是各种疾病有价值的生物标志物和治疗靶点，但它们在肠I/R损伤中的作用仍然不清楚。2023年9月6日，Nature Communications期刊（IF16.6）在线发表了一篇题为Exosomal circEZH2_005, an intestinal injury biomarker, alleviates intestinal ischemia/reperfusion injury by mediating Gprc5a signaling的研究论文。报道了一个肠I/R损伤相关的外泌体circRNA circEZH2_005，其通过介导Gprc5a信号可减轻肠I/R损伤。暗示外泌体circEZH2_005可能作为肠I/R损伤的生物标志物，靶向circEZH2_005/hnRNPA1/Gprc5a轴可能是肠I/R损伤的潜在治疗策略。

 

 

首先，为了确定外泌体circRNA是否可以指示缺血诱导的肠道损伤，研究人员从肠I/R损伤小鼠中分离出肠外泌体，并进行circRNA测序以获得这些外泌体的circRNA表达谱。结果在肠I/R外泌体中筛选出20个差异且高度表达的circRNAs，并鉴定了前5个差异表达的circRNAs，其中circ-Eya3和circ-Lbr上调，circEZH2_005、circ-Tmem267和circ-Herc3下调。进一步的研究发现，血浆外泌体circEZH2_005表达与Chiu评分（用于评估肠粘膜损伤）和IFABP水平（肠道屏障损伤的主要标志物）呈负相关。这突出了外泌体circEZH2_005与肠I/R损伤之间的潜在关系。

 

Fig1. 肠I/R模型小鼠肠损伤相关外泌体circRNAs的鉴定和筛选

 

接着，研究人员发现circEZH2_005在人和小鼠之间具有高度同源性，其在外泌体中的下调表达与I/R诱导的肠道损伤有关，因此猜测血浆外泌体circEZH2_005可能作为肠道I/R损伤诊断的特异性生物标志物。临床分析显示，circEZH2_005表达在AGI II级、III级和IV级患者灌注后逐渐降低，灌注后6 h达到峰值，并在灌注后12 h保持稳定。血浆circEZH2_005的动态峰值变化模式与IFABP相似。血浆外泌体circEZH2_005与IFABP和D-乳酸水平呈负相关。此外，外泌体circEZH2_005与AGI评分呈负相关。这些数据突出了外泌体circEZH2_005用于鉴定术后肠I/R损伤患者的诊断潜力。

 

Fig2. 外泌体circEZH2_005作为接受心肺转流手术（CPB）患者肠I/R损伤生物标志物的鉴定

 

FISH和核质分离实验显示circEZH2_005在肠道组织中优先定位于空肠隐窝，且主要在细胞质中表达。此外，circEZH2_005在Lgr5+肠道干细胞(ISCs)中高表达。因此，研究人员选择ISCs来评估circEZH2_005在体外的功能。结果显示，H/R条件下，circEZH2_005缺失加剧了类器官的形态和病理损伤，抑制了其活力，并减少了Ki67 +循环细胞以及BrdU +细胞的数量。circEZH2_005表达的变化也降低了紧密连接相关蛋白occludin和occludens-1的水平。表明circEZH2_005对H/R损伤时肠隐窝细胞的增殖具有保护作用。

 

Fig3. CircEZH2_005在体外可保护肠道类器官免受H/R损伤

 

接下来，研究人员评估了circEZH2_005对小鼠肠道I/R损伤的影响。结果发现，过表达circEZH2_005改善了I/R诱导的绒毛高度和隐窝深度的降低，逆转了I/R诱导的转运扩增细胞（Ki67+细胞）和S期细胞（BrdU+肠细胞）的减少。此外，circEZH2_005的恢复显著改善了I/R诱导的空肠隐窝中Olfm4（另一种ISC标志物）和Lgr5表达的降低。这些结果表明circEZH2_005可以通过启动ISC增殖来预防肠道I/R损伤。

 

Fig4. circEZH2_005改善体内I/R诱导的肠道组织病理学损伤

 

最后，为了探索circEZH2_005调控ISCs的潜在机制，研究人员通过RNA pull-down和蛋白质组学分析鉴定了309个与circEZH2_005特异性相互作用的蛋白。数据库预测分析和RIP实验证实了hnRNPA1是circEZH2_005的RBP候选蛋白。此外，当hnRNPA1响应I/R刺激定位于细胞核时，可观察到circEZH2_005对hnRNPA1的调节作用。circEZH2_005的敲低降低了hnRNPA1的细胞质水平，而circEZH2_005过表达促进了hnRNPA1蛋白从细胞核向细胞质的输出。进一步的实验显示，hnRNPA1的RNA识别基序2（RRM2）结构域是circEZH2_005结合所必需的，且hnRNPA1是与circEZH2_005的171 -252nt片段结合。

 

Fig5. HnRNPA1与隐窝干细胞中的circEZH2_005结合并促进其细胞质易位

 

由于hnRNPA1在调控mRNA合成、稳定性和翻译中起关键作用。因此，研究人员通过RNA测序来评估过表达circEZH2_005的肠隐窝细胞。结果鉴定出717个mRNAs显著上调，其中Gprc5a上调最多，且预测与hnRNPA1结合。沉默Gprc5a加重了类器官H/R损伤，在功能上消除了circEZH2_005对H/R损伤的类器官保护作用。进一步的RIP实验证实了hnRNPA1与Gprc5a mRNA结合，并且沉默hnRNPA1降低了Gprc5a mRNA的稳定性。此外，研究发现circEZH2_005敲低或过表达可降低或增加Gprc5a mRNA与hnRNPA1的结合。另外，circEZH2_005可调节Gprc5a mRNA的稳定性，这种作用可被hnRNPA1逆转。这些结果表明circEZH2_005通过与hnRNPA1结合提高Gprc5a的稳定性，从而促进肠I/R损伤期间ISC的增殖。

 

Fig6. CircEZH2_005通过稳定Gprc5a预防肠道I/R损伤

 

总之，本研究报道了一个肠I/R损伤相关的circRNA circEZH2_005，其在血浆外泌体中可被可靠地检测到，可以有效地区分肠I/R损伤患者和非肠I/R损伤患者。此外，circEZH2_005可以通过与hnRNPA1直接相互作用促进隐窝干细胞增殖，并增强Gprc5a在肠I/R期间的稳定性，从而减轻肠粘膜损伤。因此，本研究不仅为肠I/R损伤的早期检测提供了一种有前景的无创生物标志物，而且为防止肠I/R损伤的治疗策略开辟了一条途径。

 

Fig7. circEZH2_005通过hnRNPA1调控Gprc5a稳定性的机制示意图

 

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-41147-3





 

 

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