肝细胞癌（HCC）是全球第五大常见癌症，也是癌症死亡的第二大原因。尽管在诊断、手术技术、靶向治疗和免疫治疗方面取得了快速进展，但HCC患者的5年总生存率仍然不理想，这主要是由于复发性远端转移和对抗肿瘤药物的耐药性。HCC肿瘤发生、转移和耐药的潜在分子机制仍不清楚。因此，鉴定预后生物标志物，探索HCC肿瘤发生和进展的潜在机制，开发靶向治疗手段是至关重要的。

环状RNAs（circRNAs）是一类由内含子或外显子通过反向剪接产生的内源性非编码RNAs。它们具有共价闭合环，无5’端帽和3’端polyA尾。许多研究表明，circRNAs可以充当microRNAs（miRNAs）的海绵或与蛋白质结合，并且circRNA水平的改变会导致基因产物的异常表达。越来越多的研究发现，circRNAs在哺乳动物中广泛表达，并且在各种癌症中均有不同程度的表达，例如食管鳞状细胞癌、尿路上皮癌和结直肠癌。此外，一些circRNAs已被报道参与了HCC的发展，调节细胞增殖、肿瘤转移和糖酵解。最近的研究阐明了一些circRNA在HCC中的作用。例如，circASAP1通过充当miR-326和miR-532-5p的海绵增强MAPK1和CSF-1的表达，从而促进HCC的生长和肺转移，而circDLC1通过circDLC1-HuR-MMP1轴抑制HCC的发展和进展，可作为HCC的潜在治疗靶点。CircRNA-SORE通过抑制Wnt/β-catenin通路增加HCC细胞对索拉非尼的敏感性。然而，HCC相关的circRNAs是否通过其他调节机制发挥致瘤作用仍有待探索。

N6-甲基腺苷（m6A）修饰作为表观遗传调控的一个新领域，具有调节剪接、输出、蛋白质翻译、稳定性和肿瘤发生等多种功能，越来越受到人们的关注。m6A RNA甲基化是哺乳动物中最普遍的mRNA内部修饰，由m6A甲基转移酶（METTL3/14、WTAP、RBM15/15B、KIAA1429、VIRMA和ZC3H13，称为“writers”）、去甲基化酶（FTO、ALKBH5和ALKBH3，称为“erasers”）或m6A结合蛋白（YTHDC1/2、YTHDF1/3、IGF2BP1/3、HNRNP和eIF3，称为“readers”）。其中一些成员（例如METTL3、FTO和IGF2BPs）积极参与各种人类癌症，如急性淋巴细胞白血病、乳腺癌和子宫内膜癌。m6A和circRNAs之间的桥梁已经被建立。例如，主要定位于细胞质的m6A介导的circRNA可导致mRNA稳定性增强或蛋白质翻译增加。例如，METTL3依赖性m6A参与了DGCR8介导的miR126和pri-miR126的成熟。在HCC细胞中，KIAA1429可以诱导GATA3的m6A甲基化，促进恶性表型。尽管如此，m6A修饰的circRNAs在HCC中的作用仍需进一步研究。

近年来，基因组研究的显著进展使基因治疗成为一种治疗癌症的新方法。RNA干扰（RNAi）是一种调节靶基因的方法，有望开发出新型分子治疗药物，这些药物编码了常规疗法不适用的“非药物”靶标。RNAi分子可分为miRNA、小干扰RNA（siRNA）和短发夹RNA（shRNA）。其中，siRNA由于其强大且特异性的RNAi触发活性而显示出巨大的核酸治疗潜力。SiRNA是一种短的双链RNAs，能够使互补信使RNAs（mRNAs）进行序列特异性基因沉默，诱导mRNA降解并抑制靶蛋白的产生。基于siRNA的疗法已成为一种有前景的可用于靶向多种疾病的策略。然而，裸露siRNA的基因沉默效率非常低，因为裸露siRNA分子会被血液中的核酸酶迅速降解，并在体内迅速被肾脏清除。此外，siRNA的大尺寸和负电荷阻碍了其渗透到细胞膜并阻止其在细胞内积累。因此，有效的递送是将siRNA引入到靶细胞和组织的关键问题。为了有效地传递siRNA，已经开发了各种材料，包括脂质、聚合物、树枝状大分子、聚合物胶束和金属核纳米颗粒（NPs）。有趣的是，聚（β-氨基酯）（PAEs）为规避siRNA有效递送的困难提供了前景。PAEs是一类重要的可生物降解合成聚合物，可被细胞内酯酶降解，从而显着提高生物相容性。考虑到它们的pH敏感性、高生物相容性以及用于灵活合成和基因装载的结构多样性，它们已被研究用于作为基因和药物递送载体以及组织工程支架。

近日，Molecular Cancer（IF27.401）期刊发表了一篇题为M6A-mediated upregulation of circMDK promotes tumorigenesis and acts as a nanotherapeutic target in hepatocellular carcinoma的研究论文。文章报道了一个新型致癌circRNA circMDK，其表达上调与m6A修饰相关，并揭示了其通过miR-346/874-3p-ATG16L1轴促进HCC进展的分子机制。此外，PAEs介导的circMDK siRNA（PAE-siRNA）体内递送显著减弱了HCC小鼠模型中的肿瘤进展，暗示circMDK可能作为HCC的潜在生物标志物，并为HCC的治疗提供了一种有前途的纳米治疗策略。
首先，为了研究circRNAs在HCC肿瘤发生中的作用，研究人员对10对HCC和邻近非癌肝脏（ANL）组织进行RNA-seq分析。结果发现，与ANL组织相比，在HCC中共检测到92,204个不同的circRNAs，其中4个上调，38个下调。基于失调circRNAs的差异表达水平，研究人员发现hsa_circ_0095868（来源于MDK基因的exon 5，命名为circMDK）显著上调，HCC组织/细胞中的qRT-PCR实验进一步证实了这一结果。随后，研究人员分析了circMDK表达与HCC患者预后之间的关系，结果显示circMDK表达较高的患者预后较差。此外，研究人员通过Sanger测序、PCR分析、RNase R消化、半衰期分析、核质分离和RNA FISH对circMDK进行了表征，证实了circMDK是丰富的、环状的、稳定的转录本，并且在HCC中显著上调，主要位于细胞质中。
接下来，为了探讨circMDK在体外HCC进展中的作用，研究人员使用siRNA和过表达载体进行功能缺失性和获得性实验。结果显示沉默circMDK显著降低了HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，增加了HCC细胞的凋亡率；过表达circMDK则产生相反的结果。
紧接着，为了探索circMDK是否经历m6A修饰，研究人员首先使用在线生物信息学工具m6A Avar预测了circMDK中的m6A位点，并在circMDK的exon 5位点发现了一个RRACU m6A序列基序。进一步的研究发现IGF2BP1蛋白是circMDK的m6A结合蛋白，且IGF2BP1在HCC组织中高表达。随后，研究人员通过RNA pull-down和免疫沉淀实验证实了circMDK和IGF2BP1的相互作用。此外，circMDK与IGF2BP1的表达呈正相关，IGF2BP1的下调导致circMDK表达降低，且沉默IGF2BP1降低了circMDK的RNA稳定性。表明circMDK的m6A修饰增强了转录组稳定性。
机制研究表明，circMDK通过充当miR-346和miR-874-3p的分子海绵来上调miR-346和miR-874-3p共同的靶基因ATG16L1（自噬相关16样蛋白1），从而激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，最终通过形成的circMDK-mir-346/miR-874-3p-ATG16L1-PI3K/AKT/mTOR信号通路促进细胞增殖、迁移、侵袭并抑制细胞凋亡。
最后，考虑到circMDK上调在HCC中的关键作用，研究人员试图开发一种靶向circMDK的有效siRNA递送载体，作为HCC的潜在疗法。为此，研究人员合成了PAEs以协助递送circMDK siRNA（PAE-siRNA）。结果显示，在包括皮下、转移、原位和患者源性异种移植（PDX）肝肿瘤模型中，递送PAE-siRNA有效地抑制了HCC肿瘤进展，且无明显不良反应。
总之，本研究结果证明了circMDK是一种致癌circRNA，并通过circMDK-miR-346/miR-874-3p-ATG16L1轴在HCC的肿瘤发生和进展中发挥重要作用。本研究首次证明了一种通过靶向circRNA的PAE-siRNA复合物直接有效地抑制HCC的方法，这为HCC提供了一种有前途的纳米治疗选择。

原文链接：
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-022-01575-z

本研究使用到的miRNA靶基因3’UTR载体、miRNA mimics和inhibitors、TG16L1 siRNA和circMDK siRNA、5端cy5标记circMDK siRNA、FISH探针、FAM标记miRNA探针等产品均由锐博生物提供！更多circRNA研究产品与服务，欢迎登陆锐博生物官网（www.ribobio.com）查看或来电咨询！