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单细胞进入机理研究时代,目标是星辰大海!

人阅读 发布时间:2016-05-13 14:54

在胚胎植入 前的发育过程中,细胞存在往内胚和外胚发育的两种情况,本研究通过单细胞转录组测序,了解这种情况的发生机制。其研究结论并非开创性的,那为什么它能够发 表在Cell呢?下面我们将细化文章结构,总结文章内容去剖析整个故事的脉络,品读来自剑桥大学的研究者匠心独运之处。

科学问题

一:哺乳动物细胞在发育过程中从何时开始产生差异

二:这种细胞之间最早出现的差异,是否对特异的分化方向有着重要作用

研究过程

一:单细胞转录组测序检测胚胎发育过程中基因的时序表达模式 

Figure 1的开篇A图,从图中我们可以看到胚胎细胞分裂之后的不同走向,这让我们找到2013年汤富酬发表在NSMB上第一次对胚胎细胞大规模转录组测序的影子。其中我们可以看到PE(内胚层),EPI(外胚层),TE(滋养层)的来源不同。


Yan L,et al. Nat Struct Mol Biol. 2013 Sep;20(9):1131-9.

在这里有必要介绍下研究者的取样情况,研究者取了28个小鼠胚胎,其中8个2-Cell时期,16个4-Cell时期,4个8-Cell时期,6个16细胞期 (桑椹胚),6个32细胞期 (囊胚期);

而在汤的文章中,选取了3个卵母细胞,3个受精卵,3个2-Cell时期,3个4-Cell时期,3个8-Cell时期,2个16-Cell时期 (桑椹胚),3个32细胞期 (囊胚期);

1. 在了解到胚胎的发育过程、得到单细胞转录组的相关数据之后,研究者选择了与以往不同的筛选方式:1:FDR值<0.05找出有意义的基因 2:按照CV2 = a1/m + a0.计算高变基因,取adjust P值<0.1;

2. 研究者通过PCA聚类,皮尔斯相关系数对单细胞测序的结果以及其差异基因进行计算发现在4细胞期,细胞之间存在着异质性;

二:Sox21的表达在4细胞期高度可变,并与干性相关基因的表达有相关性

Figure 2 :在确定4细胞期中细胞存在表达异质性之后,发现Sox21为最明显的高变基因。从之前的研究中,我们了解到Sox2/Oct4均为Sox21的上游基 因,而Sox2/Oct4被认为与细胞干性相关,而后研究者反向推导,预测Sox2/Oct4在测序结果的下游基因的相关性,亦发现Sox21有明显的显 著性,故推导Sox21在4细胞时期,对其异质性有贡献;

Figure 3:得到相关结论之后,需要对Sox21在4细胞期的表达异质性进行验证,研究者取了N=164细胞期细胞,每组4个进行qPCR验证,结果如同预期,表 达差异明显,同时补加免疫荧光进行旁证;通过以上的数据分析,得出Sox21在胚胎发育过程中可能有重要作用,这在以往的多细胞研究中难以发现。

文章到这,只是对Sox21进行了现象级的描述,接下来找到Sox21的生物学功能,故事才算到高潮。

三:活体细胞追踪实验证实Sox21使得细胞更易形成胚外膜,而非多能干细胞

Figure 4:研究者开始Sox21的机制探讨,首先研究者利用Sox21 siRNA对Sox21 mRNA进行敲除实验,同时使用GAP43-GFP蛋白都细胞进行标记,而后通过时差显微镜对分裂过程中进行追踪。结果如图所示,在敲除Sox21基因之 后,细胞易于发展到胚外膜。

四:Sox21减少会导致Cdx2过早增加

Figure 5:一般来说,发育为胚外膜需要转录因子Cdx2。研究者在2细胞期减少Sox21表达,使用Gap43-RFP作为标记,结果这些细胞的Cdx2表达上 调,表明Sox21水平低的细胞首先会上调Cdx2 (mRNA和蛋白),因此很快就启动胚外膜TE谱系发育过程。

五:Sox21表达由CARM1活性调控

Sox21 表达的不均一,决定了早期胚胎的细胞命运,那调控这个异质性的上游因子是什么?研究者将目光投向了报道称在4细胞期为异质性的组蛋白H3R26,其甲基化 由CARM1介导。减少CARM1表达,多能外胚层细胞、原始内胚层细胞数目显著减少,而TE谱系细胞无变化。CARM1上调则提高了8细胞期的 Sox21、Nanog等全能性相关的基因。Sox17 (PE),Cdx2 (TE),Nanog (EPI)。

结果概述

本研究的亮点在于首次单细胞层面,通过探讨单细胞基因表达的异质性,从而揭示在胚胎发育过程中的细胞命运走向,是第一篇通过详实的论证,探讨了单细胞测序在基础研究方面的应用,具有开创性意义!

 

研究者通过对胚胎发育过程中的细胞进行单细胞转录组测序 (SMARTSeq2) 的方式,了解到Oct4以及Sox2这两个主要主导细胞干性的调节因子在4细胞期时有高度的表达异质性,其中Sox21是异质化表达最明显的基因之一。而 后的实验发现,Sox21减少的细胞趋向于成为往外胚发育,同时也伴随着分化调节因子Cdx2的过早上调。诸多现象表明,Sox21能够帮助维持细胞干 性,研究者更进一步发现Sox21的表达提升是由于CARM1的过表达引起,综上所述,异质性的基因表达,最早开始于4细胞期,主要由干性与分化能力之间 不断平衡调节而产生。

原文:Goolam M, et al.Heterogeneity in Oct4 and Sox2 Targets Biases Cell Fate in 4-Cell Mouse Embryos.Cell. 2016 Mar 24;165(1):61-74.


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