lncRNA在近些年逐渐成为生物医学领域研究热点，虽然目前关于lncRNA的研究成果与日俱增，但对于lncRNA功能来说只是冰山一角，其功能角色也依然有很多未知信息。4月27日，Nature报道了加州理工学院的研究人员关于Xist结合蛋白功能最新研究成果。

　　为了克服传统分离纯化手段的局限性，研究人员采用了一种优化的RNA反义核酸纯化方法(RNA antisense purification，RAP)。他们使用同位素标记氨基酸(SILAC)培养细胞，通过紫外交联Xist与RNA结合蛋白(RNA binding Protein，RBP)，同时用靶向Xist的反义核酸探针与lncRNA杂交，形成稳定的RNA-DNA杂交产物，后利用Protein G beads捕获探针及探针所结合的复合体，解交联后分离Xist和RBP，通过质谱鉴定RBP组成。

　　借助此方法，研究人员从雌性小鼠胚胎干细胞(female mouse ES cells，ESCs)中鉴定到10个Xist结合蛋白，通过对比未交联细胞及交联后45S RNA富集蛋白结果，确认了这10个RBP的特异性。为了确认这10个蛋白的功能，研究者用siRNA分别沉默了这些RBP，以两个X染色体基因Gpc4和Atrx为参考，验证每个RBP功能，这两个基因会受到Xist的负向调控。结果发现，单独沉默SHARP时，Xist将不再与RNA Pol II共定位于染色体上，RNA Pol II不再受到排阻，而单独沉默SAF-A时，Xist在核内扩散，表明SAF-A是Xist定位所必需的，这说明SHARP和SAF-A是Xist发挥X染色体转录沉默所必需的两个蛋白。

RAP-MS筛选结果，通过比较Xist和U1两个lncRNA的RBP中SILAC标记比例，确认lncRNA RBP特异性。该比例最高的是SHARP，达到了26倍，表明SHARP与Xist强烈互作

通过RNA FISH展示沉默SHARP、SAF-A、HDAC3和LBR后Gpc4和Atrx两个基因表达及胞内分布变化，-Dox表示Xist受到抑制，+Dox表示Xist受到诱导

lncRNA FISH展示SHARP、HDAC3或LBR被敲除后Xist与RNA Pol II共定位状态，红色为Xist，绿色为RNA Pol II

　　借助此方法，研究人员从雌性小鼠胚胎干细胞(female mouse ES cells，ESCs)中鉴定到10个Xist结合蛋白，通过对比未交联细胞及交联后45S RNA富集蛋白结果，确认了这10个RBP的特异性。为了确认这10个蛋白的功能，研究者用siRNA分别沉默了这些RBP，以两个X染色体基因Gpc4和Atrx为参考，验证每个RBP功能，这两个基因会受到Xist的负向调控。结果发现，单独沉默SHARP时，Xist将不再与RNA Pol II共定位于染色体上，RNA Pol II不再受到排阻，而单独沉默SAF-A时，Xist在核内扩散，表明SAF-A是Xist定位所必需的，这说明SHARP和SAF-A是Xist发挥X染色体转录沉默所必需的两个蛋白。

　　SHARP是哺乳动物SMRT共抑制因子复合体中第一个被鉴定出的组分，它会与HDAC3互作，是体内脱乙酰基作用及其所产生的转录沉默效应所必需的。基于这些已有研究，研究者假设，Xist可能也是借助SHARP与HDAC3互作发挥其X染色体沉默功能的。为了验证这种假设，他们在小鼠ESCs中分别沉默了HDAC3和SMRT，结果确实消除了Xist的沉默效果，表明此假设是正确的，也解释了Xist引起X染色体失活(X-chromosome inactivation，XCI)时整个染色体所出现的去乙酰化效应。

　　在XCI阶段，另一个特征是PRC2蛋白富集，促进组蛋白产生H3K27me3修饰。由 于之前RAP-MS中没有发现任何PRC2，且很多HDAC可以招募PRC2，研究者认为XCI阶段的PRC2富集也来源于HDAC3。为了验证该假设， 研究者分别沉默了HDAC3和SHARP，PRC2不再被招募到 X染色体上，也表明该假设是正确的，也纠正了之前PRC2招募模型中的结论，在之前模型中，PRC2被认为是直接结合到Xist的A重复序列处。

　　本项研究所建立的Xist沉默效应模型。该模型中，SAF-A在与Xist互作后帮助其定位到X染色体靶点区域，Xist再与SHARP互作，SHARP再与HDAC3及SMRT互作，造成X染色体去乙酰化，同时HDAC3会招募PRC2，促进组蛋白产生H3K27me3修饰，最终抑制基因表达。

　　本项研究借助RAP-MS，精确筛选到了Xist互作蛋白，并对这些RBP与Xist互作功能进行了深入研究，发现了Xist沉默X染色体过程中这些RBP的重要角色，表明lncRNA RBP在生物发育调控过程中具有重要作用。

　　相关文献：The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3