NF-κB是一种重要的转录因子，在炎症、免疫、细胞增殖、分化以及存活过程中扮演重要角色。肿瘤微环境中潜在的炎症会造成NF-κB异常激 活，更进一步促进癌症侵袭和转移。所以，NF-κB被认为是炎症和癌症之间的重要纽带。在胞质内还有一类NF-κB的抑制因子IκB(inhibitor of NF-κB)，是NF-κB的主要控制器。在静息状态下，IκB-α与NF-κB中p65、p50两个亚单位以失活状态存在于细胞质中。当上游信号激活 IKK(IκB kinase)后，活化的IKK会磷酸化IκB-α，使得p65、p50两个亚单位从失活状态活化，并从细胞质转移到细胞核内(尤其是p65亚单位)，与 相应的炎症相关基因结合，启动炎性细胞因子转录，诱发炎症。但是，之前研究已发现，炎症刺激所诱导的IKK活性比NF-κB激活所持续的时间长得多，说明 可能有一些未知的机制保护IκB不被上升的IKK磷酸化。

　　研究者希望了解这个过程是否与某些特殊lncRNA有关。他们首先使用lncRNA芯片对乳腺癌细胞MDA-MB-231进行了检测，发现了癌 细胞中NKILA会出现明显下调，并通过RACE实验获得了NKILA全长。通过对9类转移性不同的乳腺癌细胞进行检测，发现低转移乳腺癌细胞中 NKILA表达明显更高，lncRNA FISH共聚焦显微镜成像检测显示NKILA主要集中于胞质内。用p65抗体进行ChIP或使用含有κB结合位点的DNA探针进行EMSA实验确 认，NKILA TSS上游存在一个κB结合位点。如果改变MDA-MB-231细胞内NKILA水平，NF-κB活性会出现反向变化，这些结果表明NKILA是癌细胞中 NK-κB的一个负向调控因子。

　　对于NKILA抑制NF-κB激活的具体机制，研究者首先检测了NKILA对NF-κB通路中IκBα和IKK的功能。结果发现，MDA- MB-231细胞中Iκα磷酸化水平与NKILA负相关，但IKK的磷酸激酶活性不受影响;若抑制IKK酶活，NKILA将不再负向调节Iκα磷酸化，表 明IKK是在NKILA上游发挥作用。通过NKILA FISH和p65免疫染色，发现NKILA与p65共定位于胞质内，免疫共沉淀结果表明NKILA会与p65结合，再与IκBα组成 NKILA:IκBα:NF-κB复合体。通过构建一系列的NKILA突变体，利用RNA pull down、EMSA免疫共沉淀实验，结合软件分析，发现NKILA二级结构中存在三个发夹结构，帮助NKILA与p65结合，保证NKILA:NF- κB:IκBα复合体能够形成。通过质谱分析胰蛋白酶水解IκBα产生的肽段，以及进一步RNA结构预测分析和免疫共沉淀等实验，发现NKILA另一个位 置还存在第三个发夹结构，这个发夹会覆盖到IκBα的磷酸化位点(S32和S36)处，避免IκBα被IKKβ磷酸化。整个NKILA就是靠这三个发夹结 构，紧密结合p65，帮助NF-κB:IκBα:NKILA复合体形成，抑制IκBα磷酸化，并进一步抑制NF-κB，增强癌细胞凋亡，减少癌细胞转移 性。通过对乳腺癌细胞裸鼠异植瘤检测，也证明了NFKILA的表达差异与功能。大量临床样本检测结果也发现，较差预后也与NFKILA丰度下降有关。

 

　　两种乳腺癌细胞lncRNA-NKILA FISH结果，从图中可以看出，绿色标记的NKILA主要定位于胞质内，转移性更强的MDA-MB-231细胞胞质中NKILA分布明显更少
MCF7细胞中lncRNA FISH结果发现NKILA与p65共同定位于胞质内

 　 为了了解乳腺癌细胞中NKILA表达下降诱因，研究者检测了NKILA的具体表达量变化过程。结果发现，当癌细胞RNA合成受到抑制时，转移性较高的 MDA-MB-231细胞中NKILA的半衰期要短很多。研究者怀疑，可能是某些特异性的miRNA表达变化导致NKILA的快速降解。他们利用一个由 434个miRNA所组成的文库对细胞进行筛选，并通过荧光素酶报告质粒验证，发现是miR-103和miR-107导致了NKILA的快速降解，并进一 步抵消掉TNF-α及其他NF-κB激活因子在癌细胞中所引起的NKILA转录增强作用。

　　正常组织、非转移性和转移性癌组织中NKILA以及相对应的NF-κB表达变化

　　NKILA中第三个发夹结构会覆盖IκBα磷酸化位点，避免该位点被IKKβ磷酸化

NKILA覆盖IκB磷酸化位点，避免IκB被IKK磷酸化


本项研究通路示意图

　 　本项研究发现了一个与乳腺癌转移相关的重要lncRNA——NKILA，并对这个lncRNA的结构、功能以及调控机制进行了深入的研究，结果表明 NKILA失调与乳腺癌转移以及患者不良预后有重要关联，通过进一步研究，该lncRNA及其所在通路或许会成为乳腺癌治疗和预防的一个重要标志物。

　　相关文献：Liu B, Sun L, Liu Q, et al. A Cytoplasmic NF-κB Interacting Long Noncoding RNA Blocks IκB Phosphorylation and Suppresses Breast Cancer Metastasis[J]. Cancer Cell, 2015, 27(3): 370-381.